乳腺特异性表达rhPA转基因兔的繁育及表达产物的纯化与分析

发布时间：2022-12-23 02:58

　　天然人组织纤溶酶原激活剂（t-PA）存在半衰期短,容易失活,内出血风险等问题,而我们进行相应改造的重组人组织纤溶酶原激活剂（rhPA）则具有半衰期延长、产量提高、与人体相容性高等优点。本实验室构建的重组PCL25/rhPA表达载体内含有CMV增强子调控元件以及获得的转基因纯合子兔整合拷贝数2倍于半合子,导致了其高效表达的能力,表达产量及活性的提高,有助于表达水平较高的转基因兔进行纯合子培育及传代扩系。现阶段目前临床上应用的t-PA及其突变体大多是在原核大肠杆菌中表达,少部分由动物或昆虫细胞表达,从乳汁中分离纯化rhPA尚未见报道。我利用多种纯化手段,研究从转基因兔乳中将rhPA分离出来的方法,从而确保从转基因兔乳中纯化的rhPA的纯度、生物活性及稳定性。乳腺特异性表达rhPA转基因兔的筛选与繁育将山羊BLG信号肽编码区和人t-PA的K2和P结构域的编码序列克隆到含有山羊β-酪蛋白基因的5’基因组片段和CMV启动子/增强子的PCL25载体中作为嵌合启动子/增强子,构建了 PCL25/rhPA乳腺特异性表达载体。经原核显微注射PCL25/rhPA表达载体线性片段后,共获得存活仔兔48只,经... 

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
第一章 文献综述
    1 乳腺生物反应器
        1.1 乳腺生物反应器的特点
        1.2 乳腺生物反应器的研究应用
        1.3 乳腺生物反应器生产重组人组织纤溶酶原激活剂
    2 人组织纤溶酶原激活剂
        2.1 人组织纤溶酶原激活剂的结构与功能
        2.2 重组人组织纤溶酶原激活剂的研究应用
    3 显微注射法制备乳腺特异性表达转基因动物
    4 转基因纯合子动物的特性研究
    5 乳腺生物反应器生产乳蛋白的分离纯化
        5.1 乳中主要蛋白质的分析及重组蛋白分离的特点
        5.2 乳蛋白分离纯化技术
            5.2.1 亲和层析
            5.2.2 离子交换层析
            5.2.3 凝胶过滤层析
        5.3 人组织纤溶酶原激活剂及其变体的分离纯化研究
第二章 重组人纤溶酶原激活剂(rhPA)转基因兔的制备及筛选
    1 实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 主要器材
        1.3 主要试剂及配制
    2 实验方法
        2.1 转基因兔的制备
            2.1.1 构建及基因片段的准备
            2.1.2 超数排卵与同期发情
            2.1.3 回收受精卵
            2.1.4 受精卵显微注射
            2.1.5 胚胎移植
        2.2 转基因兔的整合检测
            2.2.1 兔基因组的提取
            2.2.2 PCR检测与测序
        2.3 转基因兔乳腺表达产物分析
            2.3.1 兔乳汁的收集与提取
            2.3.2 ELISA法检测转基因兔乳清
            2.3.3 SDS-PAGE电泳法分析转基因兔乳清
            2.3.4 Western Blot分析转基因兔乳清
            2.3.5 FAPA法检测表达产物的体外溶栓生物活性功能
        2.4 转基因纯合子兔的筛选培育
    3 结果
        3.1 转基因兔的获得及筛选
        3.2 转rhPA基因纯合子兔的筛选
        3.3 转基因兔乳腺表达产物分析
            3.3.1 转基因兔乳清的ELISA检测
            3.3.2 转基因兔乳清的SDS-PAGE电泳和Western Blot检测
            3.3.3 体外溶栓检测
    4 讨论
第三章 转基因兔乳中rhPA的分离纯化及鉴定
    1 材料
        1.1 rhPA乳样
        1.2 主要器材和仪器
        1.3 主要试剂与配制
    2 实验方法
        2.1 转基因兔乳前处理
            2.1.1 乳清的提取
            2.1.2 硫酸铵沉淀
            2.1.3 酸碱沉淀
            2.1.4 超滤
        2.2 亲和层析纯化转基因兔乳中rhPA
            2.2.1 赖氨酸亲和层析(Lysine HyperD)纯化乳清
            2.2.2 染料亲和层析(Blue Sepharose 6FF)纯化乳清
        2.3 离子交换层析(SP Bestarose~(TM) FF)纯化转基因兔乳中rhPA
        2.4 凝胶过滤层析(Surpdex G75)纯化转基因兔乳中rhPA
        2.5 ELISA、SDS-PAGE、Western Blot法分析纯化产物
        2.6 FAPA法检测表达产物的体外溶栓生物活性功能
        2.7 分子量及序列测定(N端/C端)鉴定纯化产物
    3 结果
        3.1 乳样前处理的结果
        3.2 赖氨酸亲和层析(Lysine HyperD)纯化结果
        3.3 染料亲和层析(Blue Sepharose 6FF)纯化结果
        3.4 离子交换层析(SP Bestarose~(TM）FF)纯化结果
        3.5 凝胶过滤层析(Surpdex G75)纯化结果
        3.6 纯化产物的初步鉴定
        3.7 FAPA法检测纯化产物体外溶栓生物活性功能
        3.8 分子量及序列测定(N端/C端)鉴定纯化产物
    4 讨论
全文总结
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]乳腺生物反应器的研究和产业化进展[J]. 付玉华,周秀梅,钱其军.  中国畜牧兽医. 2010(08)
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[4]动物乳腺生物反应器的原理及研究进展[J]. 张忠诚.  中国奶牛. 2006(04)
[5]山羊乳腺生物反应器表达人促红细胞生成素的分离纯化[J]. 田阳,苗静,陈光玉,陈辉,成国祥.  中国生物工程杂志. 2004(08)
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[7]重组人组织型纤溶酶原激活剂（rht-PA）及其突变体的纯化[J]. 朱恒奇,徐秀英,黄培堂.  中国生物化学与分子生物学报. 2003(01)
[8]重组蛋白质纯化技术[J]. 陈浩,陈于红,朱德煦,刘建宁.  中国生物工程杂志. 2002(05)
[9]重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a的制备及其在tPA突变体纯化中的应用[J]. 王新,屈贤铭,杨胜利.  生物化学与生物物理进展. 2002(03)
[10]tPA乳腺组织特异性表达载体构建及转基因小鼠建立[J]. 赵宝全,张守峰,赵君,扈荣良,章金钢,殷震.  中国兽医学报. 2002(02)

博士论文
[1]利用精子载体方法研制人组织型纤溶酶原激活剂突变体转基因羊乳腺生物反应器[D]. 叶华虎.中国人民解放军军事医学科学院 2005

硕士论文
[1]溶栓药物瑞替普酶（rPA）的大肠杆菌表达研究[D]. 田文静.天津科技大学 2010
[2]人组织型纤溶酶原激活剂原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的初步表达[D]. 杨震.重庆医科大学 2012
[3]重组组织型纤溶酶原激活剂-RGDS肽融合蛋白的表达、纯化及鉴定[D]. 龙小滨.重庆医科大学 2015



本文编号：3724574