PMA-qPCR技术用于结核分支杆菌耐药性快速检测的初步研究

发布时间：2023-01-05 11:04

　　目的：为建立结核杆菌快速药敏检测技术，缩短获得药敏检测结果的时间，及时为患者提供正确的治疗方案。我们将PMA-qPCR偶联技术应用于结核杆菌耐药诊断，以期对结核杆菌耐药性做出快速检测。 方法：根据GenBank中公布的结核分支杆菌16sRNA基因的保守序列选取一段长为206bp的基因片段设计引物。以qPCR所得初始模板量的多少作为PMA抑制死菌扩增的判定标准。用二甲基亚砜将PMA稀释到0.5mg/ml，并将PMA与结核分枝杆菌样品进行作用，用以选取和优化以下试验条件： （1）终浓度为3ug/ml的PMA与结核单菌悬液作用，设置不同曝光时间，选取PMA与DNA共价交联及游离PMA完全钝化的最佳曝光时间，并以此作为后续试验中的曝光时间；（2）用热灭活、超声裂解和紫外照射法将结核杆菌杀死并分别与3ug/ml的PMA作用，曝光后进行qPCR，通过CT值分析PMA对死菌扩增的抑制效果，选取结核分支杆菌死菌悬液制备的最佳方法；（3）不同浓度的PMA与结核分支杆菌活菌相互作用后，在650W卤素灯下曝光15min，根据qPCR结果选择不抑制结核分支杆菌活菌扩增的最小PMA浓度；（4）用热灭... 

【文章页数】：52 页

【学位级别】：硕士

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课题来源
摘要
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英文缩略词表
前言
第一章 文献综述
    前言
    1 传统的生长检测为基础的药敏试验
    2 以快速培养生长检测为基础的药敏试验
        2.1 显微镜观察药敏检测技术（MODS）
        2.2 BACTEC460系统
        2.3 BactecMGIT960系统
        2.4 噬菌体检测法
    3 以检测基因突变为基础的快速药敏试验
        3.1 以检测DNA单链构象为基础的检测方法的研究
        3.2 以检测荧光共振能量传递为基础的检测方法
        3.3 以异源双链结构分析为基础的方法
    4 商品化的突变检测技术
        4.1 基因芯片技术
        4.2 GeneXpert检测系统
        4.3 结核分枝杆菌线性探针技术
    5 直接测序法
    6 高分辨率溶解曲线（HRM）
第二章 实验部分
    实验一 三种死菌悬液制备方法对PMA-qPCR结果的影响
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 实验结果
            2.1 PMA对DNA扩增抑制效果的评估
            2.2 热灭活法对PMA-qPCR结果的影响
            2.3 超声裂解致死法对PMA-qPCR结果的影响
            2.4 紫外照射致死法对PMA-qPCR检测结果的影响
            2.5 三种制备死菌方法的比较
        3 讨论
    实验二 PMA-qPCR快速检测结核活菌方法的建立
        摘要
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果与分析
            2.1 最佳曝光时间
            2.2 不抑制活菌扩增的最小PMA浓度
            2.3 完全抑制死菌扩增的最小PMA浓度
            2.4 PMA-qPCR对不同比例活/死菌的检测
            2.5 qPCR检测的灵敏性
        3 讨论
    实验三 PMA-qPCR技术应用于结核耐药菌的快速鉴别诊断方法的初步研究
        摘要
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
            1.3 结核单菌悬液的制备
            1.4 PMA和样品的处理方法
            1.5 抗结核药物的药效学检测（刃天青药敏检测法）
            1.6 PMA-qPCR反应体系
            1.7 PMA-qPCR对结核药敏试验的检测
        2 实验结果
            2.1 刃天青药敏试验检测药物的有效性
            2.2 PMA-qPCR对结核杆菌药敏检测结果
        3 讨论
实验总结
创新点
参考文献
致谢
作者简介及发表论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]创伤弧菌PMA RTi-PCR检测技术的建立[J]. 张晶,周勇,陶霞,吴新伟.  中国人兽共患病学报. 2013(01)
[2]PMA-qPCR方法用于监测超声波灭菌效率的适用性及其应用[J]. 李聪聪,余以刚,邱杨,肖性龙,郭毅岱.  现代食品科技. 2012(04)
[3]MODS技术的研究和应用进展[J]. 黄自坤,李俊明.  中国实验诊断学. 2012(03)
[4]细菌活的非可培养状态的分子生物学检测技术研究进展[J]. 李正义,贾俊涛,祝素珍,姜英辉,房保海,雷质文.  食品科学. 2011(15)
[5]PMA与PCR结合的细菌活细胞检测方法[J]. 罗剑飞,林炜铁,郭勇.  华南理工大学学报(自然科学版). 2010(09)
[6]细胞破碎方法对几丁质脱乙酰酶活力的影响[J]. 岳洪霞,赵祥颖,田延军,张家祥,杨丽萍,韩延磊,刘建军.  山东食品发酵. 2010 (01)
[7]中国结核病流行新特点及挑战[J]. 万康林.  疾病监测. 2008(11)
[8]食品病原微生物快速检测技术研究进展[J]. 蒋志国,杜琪珍.  食品研究与开发. 2008(03)
[9]不同细胞裂解方法提取活性污泥总DNA研究[J]. 曲艳玲,廖永红,汪苹,牟文亨.  北京工商大学学报(自然科学版). 2007(02)
[10]PCR-SSCP方法用于痰标本中结核分支杆菌耐药基因的检测[J]. 包洪,于庭,刘爱忠,印璞,苍忠齐.  中国实验诊断学. 2007(01)



本文编号：3727883