鸡源CD40L的体外表达及其生物活性研究

发布时间：2017-05-17 10:00

  本文关键词：鸡源CD40L的体外表达及其生物活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：用毕赤酵母表达系统表达具有生物学活性的鸡源CD40L,应用于新城疫Lasota疫苗的免疫,探讨其免疫增强作用。方法：依据毕赤酵母对于密码子的偏好性,对鸡源CD40L基因进行优化,为了利于后期纯化,我们在序列上添加6×His标签(CAC CAC CAC CAC CAC CAC),人工合成重组质粒pwPICZalpha-Chicken-CD40L;将重组质粒线性化后,电击转入酵母,设计特异性引物鸡源CD40L-F和鸡源CD40L-R验证重组质粒是否成功导入酵母,选取阳性转化子进行诱导表达;表达上清经SDS-PAGE及Anti 6-His抗体验证;将蛋白产物经过Ni-NTA Resin柱、透析、阳离子柱及浓缩等操作,获得较高纯度的鸡源CD40L二聚体蛋白;对该蛋白进行还原性、非还原性以及去糖基化处理,用SDS-PAGE和Western blot试验验证蛋白表达过程中是否发生此类变化;将表达的蛋白按1μg/羽和0.1μg/羽的剂量与新城疫Lasota疫苗共同作用于鸡,验证其免疫增强作用。结果：1、成功构建重组质粒pwPICZalpha-bi-Chicken-CD40L;2、转化子DNA及PCR产物经测序验证重组酵母构建成功；3、成功表达鸡源CD40L二聚体蛋白,并通过两步纯化过程得到纯净产物；4、SDS-PAGE 及 Western blot验证蛋白在表达过程中发生了糖基化;5、将CD40L与新城疫Lasota疫苗配合免疫于鸡体后,通过检测机体抗体水平、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)以及丙二醛(MDA)等指标,发现鸡源CD40L二聚体蛋白无明显的免疫增效作用。结论：本试验运用毕赤酵母表达系统成功表达鸡源CD40L二聚体蛋白,并证实在1μg/羽和O.1μg/、羽的使用剂量下,鸡源CD40L蛋白对于鸡新城疫Lasota疫苗无明显的免疫增强作用。
【关键词】：鸡源CD40L蛋白 二聚体 毕赤酵母表达系统 纯化 免疫增效剂
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要7-8
• 文献综述8-14
• 1 Chicken-CD40L及其受体概述8-10
• 1.1 Chicken-CD40L概述8-10
• 1.2 Chicken-CD40L与其受体CD40的作用机理10
• 2 Chicken-CD40L的研究进展10-12
• 3 免疫增效剂的发展现状12-13
• 4 真核表达系统的概述13-14
• 前言14-15
• 试验材料及方法15-32
• 1 试剂材料15-16
• 1.1 试验动物、菌株及疫苗15
• 1.2 主要试剂及材料15-16
• 1.3 主要试验仪器16
• 2 相关试剂配制16-19
• 2.1 蛋白表达所需试剂配制16-17
• 2.2 蛋白纯化所需试剂配制17-18
• 2.3 疫苗的准备18
• 2.4 血凝试验(HI)及血凝抑制试验(HA)试剂准备18-19
• 3 试验方法19-32
• 3.1 目的基因的获得19
• 3.2 Insert Ⅰ的获得19-21
• 3.3 Insert Ⅱ的获得21-24
• 3.4 合成二聚体24
• 3.5 重组酵母的构建24-25
• 3.6 重组酵母的筛选及鉴定25-26
• 3.7 重组蛋白Chicken-CD40L在毕赤酵母中的诱导表达、鉴定及纯化26-29
• 3.8 重组蛋白Chicken-CD40L的浓缩及保存29
• 3.9 重组蛋白Chicken-CD40L生物学功能研究29-31
• 3.10 统计学分析31-32
• 试验结果32-47
• 1 获取Chicken-CD40L目的基因32-34
• 1.1 获得Chicken-CD40L-Insert Ⅰ目的基因32
• 1.2 获取Chicken-CD40L-Insert Ⅱ目的基因32-33
• 1.3 表达载体pwPICZalpha的回收鉴定33
• 1.4 重组质粒pwPICZalpha-Chicken-CD40L-Insert Ⅱ的鉴定结果33
• 1.5 二聚体的合成及鉴定33-34
• 2 重组酵母的构建、筛选与鉴定34-35
• 3 重组蛋白Chicken-CD40L的鉴定35-37
• 3.1 SDS-PAGE、Western blot验证重组蛋白Chicken-CD40L35
• 3.2 SDS-PAGE、Western blot验证重组蛋白Chicken-CD40L多聚体35-37
• 4 重组蛋白Chicken-CD40L的纯化37-38
• 4.1 表达产物经Ni-NTA Resin柱分离纯化结果37-38
• 4.2 表达产物经强阳离子交换柱分离纯化结果38
• 5 重组蛋白Chicken-CD40L的浓缩结果38-39
• 6 重组蛋白Chicken-CD40L功能验证39-47
• 6.1 新城疫抗体效价检测结果39-41
• 6.2 血清SOD活力测定结果41-43
• 6.3 血清GSH-PX测定结果43-45
• 6.4 血清MDA测定结果45-47
• 分析与讨论47-51
• 1 重组Chicken-CD40L蛋白的真核表达47-48
• 2 重组Chicken-CD40L蛋白糖基化现象48-49
• 3 重组Chicken-CD40L蛋白生物学功能验证49-51
• 全文结论51-52
• 参考文献52-57
• Abstract57-59
• 致谢59

【相似文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 温慧之;鸡源CD40L的体外表达及其生物活性研究[D];山西农业大学;2016年

2 郭夏斐;鼠源REG3α和REG3α二聚体蛋白的体外表达及对人肝癌细胞的抑制作用[D];山西农业大学;2015年

  本文关键词：鸡源CD40L的体外表达及其生物活性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：373060