奶牛冠状病毒的分子检测、基因组特征及ELISA试剂盒的研制
发布时间：2023-02-05 12:09
牛冠状病毒（Bovine Coronavirus,BCoV）主要引起新生犊牛腹泻、成年牛冬季腹泻和牛呼吸道疾病,在全球范围内造成了严重的经济损失。血清流行病学资料显示国内BCoV阳性率高且分布广泛,但关于BCoV的病原流行病学资料欠缺。本研究的目的是开展国内部分地区奶牛BCoV分子检测及基因组研究,同时研制基于重组N蛋白间接ELISA抗体检测试剂盒,取得如下成果:1.国内部分省区奶牛冠状病毒的分子检测2017年9月到2018年5月,采集了6省14个奶牛场的190份犊牛腹泻粪便样本,采用特异性RT-PCR方法检测BCoV的阳性率,并选取代表性样本同时克隆纤突蛋白（S）、血凝素/酯酶蛋白（HE）、核衣壳蛋白（N）和跨膜蛋白（M）的完整基因,分析其分子特征。结果表明,BCoV的检测率为18.95%,场阳性率为92.86%（13/14）,表明BCoV在采样省区的奶牛中广泛流行;从4个省8个牛场的13个阳性样本中同时成功扩增出完整的S、HE、N和M基因,与GenBank中的全部163条完整BCoV S基因相比,本实验克隆的12条序列和中国其它13个毒株（12株牦牛和1株奶牛）在进化树上聚为独立一...
【文章页数】：94 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 牛冠状病毒流行特征及其S和HE基因的研究进展
1 牛冠状病毒的流行情况
1.1 牛冠状病毒引起的新生犊牛腹泻
1.2 牛冠状病毒引起的成年牛冬痢疾
1.3 牛冠状病毒引起的牛呼吸道疾病
1.4 牛冠状病毒国内外的流行情况
1.5 牛冠状病毒跨中间传播
2 牛冠状病毒S蛋白的研究进展
2.1 牛冠状病毒S蛋白的分子特征
2.2 牛冠状病毒S蛋白的功能
3 牛冠状病毒HE蛋白的研究进展
3.1 牛冠状病毒HE蛋白的起源
3.2 牛冠状病毒HE蛋白的分子特征
3.3 牛冠状病毒HE蛋白功能
4 小结
第二章 国内部分省区奶牛冠状病毒分子检测
1 材料与方法
1.1 临床样本
1.2 试验仪器
1.3 主要试剂
1.4 引物的设计与合成
1.5 RNA的提取与c DNA的合成
1.6 BCoV阳性质粒的制备
1.7 PCR扩增与测序
1.8 序列的拼接及进化关系分析
2 结果
2.1 2017 ~2018 年中国部分省区奶牛BCo V分子流行学调查
2.2 BCoV S、HE、N和 M完整基因的克隆结果
2.3 BCoV S、HE、N和 M基因序列、系统发育和重组分析结果
3 讨论
3.1 部分省区奶牛BCoV的病原流行病学
3.2 BCoV S、HE、N和 M基因的分子特征
4 小结
第三章 奶牛冠状病毒SWUN/A10/2018 的基因组研究
1 材料和方法
1.1 病毒样本
1.2 主要仪器
1.3 主要试剂
1.4 引物的设计与合成
1.5 病毒RNA的提取与c DNA的合成
1.6 BCoV阳性质粒的制备
1.7 PCR扩增与测序
1.8 全基因序列的拼接及分析
2 结果
2.1 分离株SWUN/A10/2018 基因组序列及结构特征
2.2 分离株SWUN/A10/2018 毒株S基因分子特征
2.3 分离株SWUN/A10/2018 毒株HE基因分子特征
2.4 分离株SWUN/A10/2018 毒株N、M和 E基因分子特征
2.5 分离株SWUN/A10/2018 毒株ORF1a和 ORF1b基因分子特征
3 讨论
3.1 SWUN/A10/2018 基因组特征
3.2 SWUN/A10/2018 S基因的分子特征
3.3 SWUN/A10/2018 HE基因变异
4 小结
第四章 基于重组N蛋白检测BCoV抗体的间接ELISA试剂盒的研发
1 材料和方法
1.1 主要质粒、试验用血清
1.2 主要仪器
1.3 主要试剂
1.4 BCoV重组N蛋白的表达
1.5 基于重组N蛋白间接ELISA检测方法条件的优化
1.6 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定
1.7 基于重组N蛋白间接ELISA检测方法的评价
1.8 试剂盒的组装
1.9 对川西北牦牛血清BCo V流行病学调查
2 结果
2.1 重组原核表达载体的构建结果
2.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达及SDS-PAGE凝胶电泳结果
2.3 表达蛋白的回收、纯化及Western blot鉴定结果
2.4 基于重组N蛋白间接ELISA检测方法条件的优化结果
2.5 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定结果
2.6 基于重组N蛋白间接ELISA检测方法的评价结果
2.7 试剂盒的组装结果
2.8 对川西北牦牛血清BCo V流行病学调查结果
3 讨论
3.1 BCoV的间接ELISA方法
3.2 BCoV的重组N蛋白的表达
3.3 基于重组N蛋白检测BCo V抗体的间接ELISA方法的建立
4 小节
结论及创新
参考文献
作者在攻读硕士学位期间发表的论文
致谢
本文编号：3734945
【文章页数】：94 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 牛冠状病毒流行特征及其S和HE基因的研究进展
1 牛冠状病毒的流行情况
1.1 牛冠状病毒引起的新生犊牛腹泻
1.2 牛冠状病毒引起的成年牛冬痢疾
1.3 牛冠状病毒引起的牛呼吸道疾病
1.4 牛冠状病毒国内外的流行情况
1.5 牛冠状病毒跨中间传播
2 牛冠状病毒S蛋白的研究进展
2.1 牛冠状病毒S蛋白的分子特征
2.2 牛冠状病毒S蛋白的功能
3 牛冠状病毒HE蛋白的研究进展
3.1 牛冠状病毒HE蛋白的起源
3.2 牛冠状病毒HE蛋白的分子特征
3.3 牛冠状病毒HE蛋白功能
4 小结
第二章 国内部分省区奶牛冠状病毒分子检测
1 材料与方法
1.1 临床样本
1.2 试验仪器
1.3 主要试剂
1.4 引物的设计与合成
1.5 RNA的提取与c DNA的合成
1.6 BCoV阳性质粒的制备
1.7 PCR扩增与测序
1.8 序列的拼接及进化关系分析
2 结果
2.1 2017 ~2018 年中国部分省区奶牛BCo V分子流行学调查
2.2 BCoV S、HE、N和 M完整基因的克隆结果
2.3 BCoV S、HE、N和 M基因序列、系统发育和重组分析结果
3 讨论
3.1 部分省区奶牛BCoV的病原流行病学
3.2 BCoV S、HE、N和 M基因的分子特征
4 小结
第三章 奶牛冠状病毒SWUN/A10/2018 的基因组研究
1 材料和方法
1.1 病毒样本
1.2 主要仪器
1.3 主要试剂
1.4 引物的设计与合成
1.5 病毒RNA的提取与c DNA的合成
1.6 BCoV阳性质粒的制备
1.7 PCR扩增与测序
1.8 全基因序列的拼接及分析
2 结果
2.1 分离株SWUN/A10/2018 基因组序列及结构特征
2.2 分离株SWUN/A10/2018 毒株S基因分子特征
2.3 分离株SWUN/A10/2018 毒株HE基因分子特征
2.4 分离株SWUN/A10/2018 毒株N、M和 E基因分子特征
2.5 分离株SWUN/A10/2018 毒株ORF1a和 ORF1b基因分子特征
3 讨论
3.1 SWUN/A10/2018 基因组特征
3.2 SWUN/A10/2018 S基因的分子特征
3.3 SWUN/A10/2018 HE基因变异
4 小结
第四章 基于重组N蛋白检测BCoV抗体的间接ELISA试剂盒的研发
1 材料和方法
1.1 主要质粒、试验用血清
1.2 主要仪器
1.3 主要试剂
1.4 BCoV重组N蛋白的表达
1.5 基于重组N蛋白间接ELISA检测方法条件的优化
1.6 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定
1.7 基于重组N蛋白间接ELISA检测方法的评价
1.8 试剂盒的组装
1.9 对川西北牦牛血清BCo V流行病学调查
2 结果
2.1 重组原核表达载体的构建结果
2.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达及SDS-PAGE凝胶电泳结果
2.3 表达蛋白的回收、纯化及Western blot鉴定结果
2.4 基于重组N蛋白间接ELISA检测方法条件的优化结果
2.5 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定结果
2.6 基于重组N蛋白间接ELISA检测方法的评价结果
2.7 试剂盒的组装结果
2.8 对川西北牦牛血清BCo V流行病学调查结果
3 讨论
3.1 BCoV的间接ELISA方法
3.2 BCoV的重组N蛋白的表达
3.3 基于重组N蛋白检测BCo V抗体的间接ELISA方法的建立
4 小节
结论及创新
参考文献
作者在攻读硕士学位期间发表的论文
致谢
本文编号：3734945
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3734945.html
