PPRV全长基因克隆及H蛋白与SLAM受体相互作用的研究

发布时间：2023-02-07 17:47

　　小反刍兽疫（peste des petits ruminants,PPR）是由副粘病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒属（Morbillivirus）小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）感染小反刍动物而引起的一种急性传染病,临床表现为发热、口炎、腹泻和肺炎等特征,发病过程以高发病率和高死亡率为特征。我国西藏阿里地区于2007年首次暴发,近两年,新疆、内蒙古自治区、辽宁、山东、湖南、安徽、广西、云南、贵州等地相继发生疫情,小反刍兽疫防控任务十分严峻,有效防控小反刍兽疫的相关生物制品的研发势在必行。但截至目前,PPRV的致病机制还有待于进一步研究。因此,建立PPRV的反向遗传学技术操作平台就显得十分重要。国内外学者为深入了解本病的发病机理,为新型载体疫苗的研制提供基础,开展了PPRV感染性克隆的相关研究工作。本研究结合当前副黏病毒科病毒感染性克隆和麻疹病毒感染性克隆的研究方法的基础上,通过对pBluescript?II KS（+）载体和pVAX1载体的改造,获得可作为通用型负链不分节段RNA病毒的反向遗传载体,pBKS-H... 

【文章页数】：75 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 综述
    1.1 麻疹病毒属反向遗传研究进展
        1.1.1 麻疹病毒的感染性克隆
        1.1.2 牛瘟病毒的感染性克隆
        1.1.3 犬瘟热病毒的感染性克隆
        1.1.4 小反刍兽疫病毒的感染性克隆
    1.2 反向遗传操作系统
        1.2.1 基于T7 RNA聚合酶的反向遗传操作系统
        1.2.2 基于RNA聚合酶II的反向遗传操作系统
    1.3 麻疹病毒属重要受体
        1.3.1 CD150/Signaling Lymphocyte Activation Molecule (SLAM)
        1.3.2 Nectin 4/Poliovirus receptor-related 4(PVRL4)
        1.3.3 CD46/Membrane Cofactor Protein (MCP)
        1.3.4 CD209/Dendritic Cell-Specific Intracellular Adhesion Molecule3-Grabbing Nonintegrin (DC-SIGN)
        1.3.5 CD147/Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer (EMMPRIN)
        1.3.6 Neurokinin-1 (NK-1)
    1.4 研究目的及意义
第二章 小反刍兽疫病毒全长基因组及微基因组的构建
    2.1 材料
        2.1.1 病毒、菌种和细胞
        2.1.2 载体与主要试剂
    2.2 方法
        2.2.1 引物设计
        2.2.2 PPRV TCID50的测定
        2.2.3 PPRV cDNA的制备
        2.2.4 目的基因的RT-PCR扩增及鉴定
        2.2.5 构建带有核酶的载体
        2.2.6 全长cDNA的连接
        2.2.7 辅助质粒的构建及酶切鉴定
        2.2.8 辅助质粒的活性鉴定
        2.2.9 微基因组的构建及鉴定
    2.3 结果
        2.3.1 TCID50的测定
        2.3.2 RT-PCR扩增结果
        2.3.3 阳性质粒的鉴定结果
        2.3.4 F1F2片段的连接及鉴定
        2.3.5 F3F4片段的连接及鉴定
        2.3.6 F5F6F7片段的连接及鉴定
        2.3.7 全长的连接及鉴定
        2.3.8 全长测序结果
        2.3.9 辅助性质粒的构建方法
        2.3.10 辅助性质粒的鉴定
        2.3.11 辅助性质粒的活性鉴定结果
        2.3.12 微基因组的构建方法
        2.3.13 微基因组的鉴定
        2.3.14 PPRV微基因组的拯救
    2.4 讨论
第三章 山羊SLAM受体细胞系的构建及鉴定
    3.1 材料
        3.1.1 病毒、菌种和细胞
        3.1.2 载体与主要试剂
    3.2 方法
        3.2.1 SLAM基因的扩增及鉴定
        3.2.2 SLAM基因的氨基酸分析
        3.2.3 SLAM基因稳转细胞制备及鉴定
    3.3 结果
        3.3.1 PCR扩增结果
        3.3.2 酶切鉴定结果
        3.3.3 SLAM基因的氨基酸分析结果
        3.3.4 p Display-SLAM的酶切鉴定
        3.3.5 RT-PCR的鉴定
        3.3.6 Western Blot鉴定
        3.3.7 稳转细胞系的接毒实验
    3.4 讨论
第四章 H蛋白与SLAM受体相互作用的研究
    4.1 材料
        4.1.1 病毒、菌种和细胞
        4.1.2 载体与主要试剂
    4.2 方法
        4.2.1 PPRV H蛋白分析
        4.2.2 H与SLAM受体相互作用预测
        4.2.3 H蛋白胞外区的表达及分段表达
        4.2.4 SLAM基因的表达
        4.2.5 PPRV Nigeria 75/1 克隆株H蛋白与山羊SLAM受体相互作用
    4.3 结果
        4.3.1 PPRV H蛋白分析结果
        4.3.2 H蛋白与SLAM受体蛋白模型预测结果
        4.3.3 PPRV Nigeria 75/1 克隆株、PPRV Nigeria 75/1 疫苗株的H蛋白与不同SLAM受体相互作用预测结果
        4.3.4 Tibet 07 株H蛋白不同SLAM相互作用预测结果
        4.3.5 PPRV Nigeria 75/1 克隆株和Tibet 07 株H基因的扩增及鉴定结果
        4.3.6 山羊SLAM受体胞外区的扩增及鉴定结果
        4.3.7 PPRV Nigeria 75/1 克隆株H蛋白与山羊SLAM受体相互作用结果
    4.4 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历



本文编号：3737191