GDF9对牛卵泡和胚胎发育及精子发生的作用及其机制研究

发布时间：2023-02-07 21:39

　　TGF-β超家族作为信号转导的细胞外配体调节细胞的分化、凋亡和增殖,在生殖细胞发育调控中起重要作用。GDF9属于TGF-p超家族成员,在人、羊、鼠卵泡发育和排卵过程中发挥重要作用；此外,在鼠、猫、羊驼等动物睾丸中检测到了GDF9及其受体的表达。体外研究发现,GDF9通过影响与鼠睾丸支持细胞紧密连接相关蛋白的表达与定位,可影响支持细胞间紧密连接功能。然而,GDF9及其受体在牛睾丸中的表达分布,以及GDF9是否参与牛支持细胞、腔前卵泡和胚胎发育的调节研究报道较少。基于此,本研究从基因多态性着手,分析牛GDF9基因多态性与超数排卵效果、胚胎移植妊娠率以及精液品质的关系；其次探讨GDF9对牛腔前卵泡生长发育与存活的作用;再者通过鉴定GDF9及其受体BMPRII和ALK5在牛睾丸的表达与分布,研究GDF9对牛睾丸支持细胞增殖与凋亡以及支持细胞紧密连接能力的作用,以探讨GDF9对牛卵泡发育和精子发生及胚胎发育的作用及其机制。具体内容如下：1、牛GDF9基因多态性对超数排卵效果、胚胎移植妊娠率以及精液品质的影响利用候选基因法,采用PCR-SSCP、PCR-RFLP和测序等技术,研究了GDF9基因在中...

【文章页数】：123 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略词表
第一部分 文献综述
    1 GDF9研究进展
        1.1 GDF9基本结构
        1.2 GDF9信号转导通路
        1.3 GDF9对卵泡发育的调控
            1.3.1 生长因子对卵泡发育的调控作用
            1.3.2 GDF9对卵泡发育的影响
        1.4 GDF9对睾丸发育和精子发生的影响
    2 腔前卵泡体外培养研究进展
        2.1 卵泡生长发育的一般规律和调控模式
        2.2 体外腔前卵泡培养研究进展
    3 睾丸支持细胞与精子发生
        3.1 精子发生的过程及基因表达调控
        3.2 睾丸支持细胞在精子发生中的作用
    4 研究目的与意义
第二部分 试验研究
    实验一 牛GDF9基因多态性及其与超数排卵效果的关系
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 实验材料
                2.1.1 实验动物
                2.1.2 试验样品的采集
                2.1.3 主要仪器设备
                2.1.4 主要酶、试剂和试剂盒
                2.1.5 主要溶液的配置
            2.2 研究方法
                2.2.1 中国荷斯坦奶牛超数排卵处理程序
                2.2.2 冲胚及数据收集
                2.2.3 牛基因组DNA的提取及检测
                2.2.4 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测
                2.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测
                2.2.6 PCR-SSCP检测
                2.2.7 目的片段回收纯化
                2.2.8 引物设计及PCR反应条件
                2.2.9 酶切位点的引入与基因分型
            2.3 统计分析
        3 结果
            3.1 基因组DNA提取物
            3.2 GDF9基因PCR扩增产物
            3.3 GDF9基因SSCP多态性
            3.4 GDF9基因RFLP多态性
            3.5 GDF9基因型频率和等位基因频率
            3.6 GDF9基因多态性与奶牛超数排卵效果的关系
        4 讨论
            4.1 GDF9基因突变对超数排卵的影响
            4.2 GDF9基因突变影响超数排卵的机制解析
        5 小结
    实验二：牛GDF9基因多态性及其与胚胎移植妊娠率的关系
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 材料
                2.1.1 试验动物
                2.1.2 试验样品的采集
            2.2 方法
                2.2.1 受体牛同期发情处理
                2.2.2 胚胎移植及妊娠检查
                2.2.3 基因组DNA提取
                2.2.4 GDF9基因多态性检测
                2.2.5 血清激素浓度的测定
                2.2.6 数据统计
        3 结果
            3.1 GDF9基因PCR扩增产物
            3.2 GDF9基因多态性
            3.3 GDF9基因型频率和等位基因频率
            3.4 GDF9基因多态性与冷冻胚胎移植妊娠率的关系
            3.5 GDF9基因多态性与胚胎移植时受体血清激素的关系
        4 讨论
            4.1 GDF9基因在鲁西黄牛群体中具有多态性
            4.2 GDF9基因突变与胚胎移植妊娠率关系不大
        5 小结
    实验三：外源GDF9对牛腔前卵泡体外培养效果的影响
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 材料
                2.1.1 实验材料及仪器设备
                2.1.2 主要试剂
                2.1.3 主要溶液配制
            2.2 方法
                2.2.1 卵巢皮质的获得
                2.2.2 试验设计与培养条件
                2.2.3 组织学检测
                2.2.4 TUNEL检测
                2.2.5 统计分析
        3 结果
            3.1 腔前卵泡活力
            3.2 原始卵泡的激活和生长
            3.3 腔前卵泡生长
        4 讨论
        5 小结
    实验四：牛GDF9基因多态性及其与精液品质的关系
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 试验动物与数据收集
            2.2 试验方法
                2.2.1 牛冻精基因组DNA提取
                2.2.2 GDF9基因多态性检测
                2.2.3 统计分析
        3 结果
            3.1 GDF9基因PCR扩增产物
            3.2 GDF9基因多态性
            3.3 GDF9基因型频率和等位基因频率
            3.4 GDF9基因多态性与荷斯坦种公牛精液品质的关系
        4 讨论
        5 小结
    实验五：GDF9及其受体在牛睾丸、睾丸支持细胞中的鉴定
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 材料
                2.1.1 实验材料
                2.1.2 主要仪器设备
                2.1.3 主要试剂及试剂盒
            2.2 实验方法
                2.2.1 牛睾丸支持细胞的分离与培养
                2.2.2 牛睾丸组织与支持细胞总RNA提取及检测
                2.2.3 cDNA第一链合成
                2.2.4 PCR反应程序和产物检测
                2.2.5 蛋白的提取及Western blot检测
                2.2.6 免疫组织化学染色
        3 结果
            3.1 牛睾丸组织和支持细胞中提取总RNA质量检测
            3.2 GDF9及其受体在牛睾丸支持细胞中的表达
            3.3 GDF9及其受体在牛睾丸组织中的表达
            3.4 GDF9蛋白在牛睾丸组织和支持细胞中的表达与分布
        4 讨论
        5 小结
    实验六：外源GDF9对牛睾丸支持细胞发育和功能的影响
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 材料
                2.1.1 实验材料
                2.1.2 主要仪器设备
                2.1.3 主要试剂及配置
            2.2 实验方法
                2.2.1 牛睾丸支持细胞的分离与培养
                2.2.2 外源GDF9的处理
                2.2.3 牛支持细胞总RNA提取及反转录
                2.2.4 细胞周期检测
                2.2.5 细胞凋亡检测
                2.2.6 细胞增殖检测
                2.2.7 跨膜电阻值测定
                2.2.8 实时荧光定量PCR
                2.2.9 统计分析
        3 结果
            3.1 GDF9影响牛支持细胞周期
            3.2 GDF9促进牛支持细胞增殖
            3.3 GDF9抑制牛支持细胞凋亡
            3.5 GDF9对牛occludin和claudin-11 mRNA表达的影响
            3.6 GDF9对牛支持细胞紧密连接能力的影响
        4 讨论
        5 小结
第三部分 全文结论
第四部分 创新点和不足
    本研究的创新之处
    本研究的不足之处
参考文献
发表的主要论文
致谢



本文编号：3737467