抗猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及功能验证

发布时间：2023-02-09 08:35

　　猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种以脱水、腹泻、肠绒毛严重萎缩为主要病变的传染病。2010年以来,PEDV变异株在世界多国猪场相继暴发流行,其对哺乳仔猪致病性强、死亡率高,一周龄以下的仔猪感染后其致死率可高达100%。该PEDV变异株的出现在我国及全球造成重大经济损失,严重威胁着养猪业的健康发展,开发用于检测PEDV感染的制剂和相应方法显得尤为重要且紧迫。核衣壳蛋白(N)在不同的PEDV毒株间高度保守、且在宿主感染早期合成,因此,PEDV N蛋白是作为感染早期检测的理想靶标。为有助于开发一系列检测PEDV感染的方法,本研究制备了抗PEDV N蛋白的单克隆抗体,并测试了其在不同检测方法中的应用前景。首先,本研究从PEDV LJX/2014毒株中采用RT-PCR方法扩增获得了N基因,随后将其因克隆至pET-30a(+)原核表达载体,获得了表达PEDV N蛋白的重组表达质粒,并将其命名为pET-N。将pET-N转化至BL-21(DE3)感受态细胞中表达N蛋白,结果表明,该目标蛋白以分泌型及包涵体形式同时表达。经优化表达条件,最终获得大量分泌型表达的N蛋白。采用镍柱亲和层析...

【文章页数】：52 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 冠状病毒
    1.2 常见的猪冠状病毒
    1.3 猪流行性腹泻(PEDV)及N蛋白
        1.3.1 PEDV的发展及流行
        1.3.2 PEDV的结构组成及功能
    1.4 抗体
    1.5 单克隆抗体
    1.6 研究目的与意义
第二章 PEDV N蛋白的基因克隆、表达及纯化
    2.1 材料
        2.1.1 病毒株、菌株、细胞株和质粒
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 PEDV N蛋白的基因扩增
            2.2.1.1 PEDV的 RNA提取
            2.2.1.2 PEDV N蛋白基因的扩增
        2.2.2 重组质粒pET-N的构建
            2.2.2.1 限制性内切酶酶切实验
            2.2.2.2 重组质粒的连接
            2.2.2.3 连接产物的转化
            2.2.2.4 重组质粒的提取
        2.2.3 质粒pET-N阳性克隆的鉴定
            2.2.3.1 质粒pET-N的双酶切鉴定
            2.2.3.2 重组质粒的PCR鉴定
            2.2.3.3 重组质粒的测序鉴定
        2.2.4 PEDV N蛋白的表达、鉴定及纯化
            2.2.4.1 PEDV N蛋白的表达
            2.2.4.2 PEDV N蛋白的SDS-PAGE及 Western blotting分析鉴定
            2.2.4.3 PEDV N蛋白的纯化
    2.3 实验结果
        2.3.1 PEDV N基因的克隆
        2.3.2 PEDV N蛋白的表达
        2.3.3 PEDV N蛋白的纯化
    2.4 讨论
第三章 抗PEDV N蛋白的mAbs的制备及验证
    3.1 材料
        3.1.1 病毒株、菌株、细胞株和质粒
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器设备
        3.1.4 实验动物
    3.2 实验方法
        3.2.1 小鼠免疫
            3.2.1.1 酶联免疫吸附实验(ELISA)
        3.2.2 杂交瘤细胞的制备
        3.2.3 筛选杂交瘤细胞筛选及鉴定
    3.3 实验结果
        3.3.1 抗PEDV N蛋白mAbs的制备
        3.3.2 抗PEDV N蛋白mAbs的亚类鉴定
        3.3.3 抗PEDV N蛋白mAbs的腹水效价测定
        3.3.4 单克隆抗体5F3 的亲和性
    3.4 讨论
第四章 抗PEDV N蛋白的mAbs的功能验证
    4.1 材料
        4.1.1 病毒株、菌株、细胞株和质粒
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要仪器设备
    4.2 实验方法
        4.2.1 间接免疫荧光(IFA)
        4.2.2 流式细胞术
    4.3 实验结果
        4.3.1 抗PEDV N蛋白mAbs的 ELISA反应性检测
        4.3.2 抗PEDV N蛋白mAbs的 Western blotting反应性检测
        4.3.3 抗PEDV N蛋白mAbs的 IFA反应性检测
        4.3.4 抗PEDV N蛋白mAbs的流式细胞术反应性检测
        4.3.5 单克隆抗体5F3 的亲和性检测
    4.4 讨论
第五章 抗PEDV N蛋白的mAbs的抗原表位鉴定
    5.1 材料
        5.1.1 病毒株、菌株、细胞株和质粒
        5.1.2 主要试剂
        5.1.3 主要仪器设备
    5.2 实验方法
        5.2.1 PEDV N蛋白截短肽的表达
        5.2.2 PEDV N蛋白截短肽的合成
    5.3 实验结果
        5.3.1 PEDV N蛋白截短肽的表达
        5.3.2 PEDV N蛋白截短肽的验证
        5.3.3 mAb精细表位的鉴定
    5.4 讨论
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历



本文编号：3738573