脑心肌炎病毒结构蛋白VP2拮抗IFN-β信号通路活化作用的研究
发布时间：2023-02-11 09:33
脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)是单股正链无囊膜的小RNA病毒,人和动物感染后可引起脑炎、心肌炎以及神经系统疾病和生殖障碍等,是重要的人畜共患病原体,对人类健康具有重要的公共卫生学意义。病毒入侵宿主时可通过多种方式和策略逃避宿主的天然免疫应答机制,很多病毒利用自身编码的不同蛋白拮抗或抑制宿主天然免疫过程,从而实现病毒在宿主细胞内的有效增殖。本研究前期通过实时荧光定量PCR技术筛选了能够显著促进EMCV体外增殖的结构蛋白VP2,为探明VP2促进EMCV体外增殖的作用机制,进一步深入研究了VP2在IFN-β产生及RLRs信号通路中的调控作用。通过免疫印迹、免疫共沉淀及激光共聚焦等实验筛选并验证受VP2蛋白调控的RLRs信号通路的作用靶分子以及VP2抑制RLRs信号通路的可能作用机理。本研究获得以下研究结果:1.EMCV结构蛋白VP1、VP2和VP3均可显著促进EMCV体外增殖,其中VP2蛋白对病毒的增殖效果最明显。此外,VP2促进EMCV体外增殖与RLRs信号通路活化和IFN-β产生密切相关。2.结构蛋白VP2以剂量依赖方式显著抑制EMCV、P...
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
项目资金来源
摘要
Abstract
缩略词英文对照表
第一章 脑心肌炎病毒和病毒蛋白参与免疫应答的研究进展
1 脑心肌炎病毒
1.1 EMCV的来历和分类
1.2 EMCV病毒特征和基因组结构
1.3 EMCV病毒蛋白
1.4 EMCV病毒衣壳的三维结构
1.5 EMCV病毒周期
1.5.1 病毒吸附和进入
1.5.2 病毒翻译
1.5.3 EMCV病毒多聚蛋白裂解
1.5.4 EMCV病毒复制
1.5.5 EMCV病毒组装和释放
2 抗病毒信号转导途径及EMCV免疫学研究
2.1 RLRs/MAVS信号途径
2.2 JAK/STATs信号途径
2.3 EMCV免疫逃逸机制
3 本研究的目的和意义
第二章 EMCV VP2 蛋白对病毒体外增殖的作用研究
1 实验材料
1.1 细胞、质粒和病毒
1.2 主要试剂
1.3 主要试剂的配制
1.4 主要仪器设备
2 实验方法
2.1 细胞复苏与培养
2.2 EMCV培养与扩增
2.3 HEK293细胞瞬时转染及EMCV感染
2.4 EMCV结构蛋白VP1、VP2和VP3真核表达载体构建
2.4.1 EMCV病毒RNA提取
2.4.2 EMCV病毒RNA反转录cDNA
2.4.3 EMCV VP1、VP2和VP3基因PCR扩增
2.4.4 VP1、VP2和VP3重组质粒构建及双酶切验证
2.4.5 VP1、VP2和VP3重组表达质粒提取及其在HEK293细胞中的表达
2.5 VP2对细胞的毒性实验检测
2.6 实时荧光定量PCR检测EMCV拷贝数
2.7 TCID50检测EMCV毒价
2.8 ELISA检测VP2对IFN-β表达的影响
2.9 VP2对EMCV介导的IFN-β及JAK/ STAT通路相关因子转录的影响
2.9.1 qPCR检测EMCV感染HEK293细胞中IFN-βmRNA
2.9.2 qPCR检测IFN-β及JAK/ STAT通路相关因子mRNA表达
2.10 VP2蛋白对RLRs通路相关因子表达的影响
2.11 统计学分析
3 实验结果
3.1 EMCV结构蛋白真核表达载体构建及验证
3.2 EMCV结构蛋白促进病毒体外增殖
3.3 VP2抑制EMCV诱导的IFN-β产生及JAK/STAT信号通路下游因子转录
3.4 EMCV VP2抑制病毒诱导的RLRs信号通路蛋白表达
4 小结
第三章 EMCV VP2 蛋白对RLRs信号通路的调控作用研究
1 实验材料
1.1 细胞、质粒和病毒
1.2 主要试剂
1.3 主要试剂的配制
1.4 主要仪器设备
2 实验方法
2.1 EMCV VP2对Poly(I:C)介导的RLRs通路相关因子表达的影响
2.1.1 细胞培养与转染
2.1.2 细胞总RNA提取及反转录cDNA
2.1.3 qPCR检测IFN-β及RLRs通路相关因子mRNA
2.1.4 ELISA检测HEK293细胞中IFN-β表达
2.2 EMCV VP2对Poly(I:C)诱导的IRF3和STAT1磷酸化和核转移的影响
2.3 EMCV VP2对外源MDA5、MAVS、TBK1和IRF3诱导IFN-β转录和表达的影响
2.4 EMCV VP2对MDA5、MAVS、TBK1和IRF3诱导RLRs通路关键蛋白表达的影响
2.5 统计学分析
3 实验结果
3.1 EMCV VP2抑制Poly(I:C)诱导的RLRs信号通路相关因子mRNA
3.2 EMCV VP2抑制Poly(I:C)诱导的信号通路中IRF3和STAT1的磷酸化
3.3 EMCV VP2抑制RLRs通路关键蛋白诱导的IFN-β转录和表达
3.4 EMCV VP2抑制RLRs通路关键蛋白诱导的RLRs蛋白的表达
4 小结与讨论
第四章 EMCV VP2蛋白与RLRs信号通路关键蛋白的相互作用研究
1 实验材料
1.1 细胞及质粒
1.2 主要试剂
1.3 主要试剂的配制
1.4 主要仪器设备
2 实验方法
2.1 激光共聚焦显微镜观察VP2蛋白与RLRs信号通路关键蛋白的共定位分析
2.1.1 细胞培养与转染
2.1.2 IFA实验及激光共聚焦显微镜观察照像
2.2 免疫共沉淀Co-IP检测VP2蛋白与RLRs信号通路关键蛋白的相互作用
2.2.1 细胞培养与转染
2.2.2 Co-IP实验
2.3 蛋白酶体途径抑制剂MG132处理对VP2抑制RLRs信号通路关键蛋白的影响
3.实验结果
3.1 激光共聚焦验证VP2蛋白与MDA5、MAVS、TBK1和IFR3蛋白共定位
3.2 Co-IP验证VP2蛋白与MDA5、MAVS和TBK1蛋白相互作用
3.3 VP2通过蛋白酶体途径抑制RLRs信号通路关键蛋白的表达
4 小结与讨论
第五章 全文总结
参考文献
致谢
附录
作者简介
硕士期间主持的科研项目
硕士期间发表的论文
本文编号：3740139
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
项目资金来源
摘要
Abstract
缩略词英文对照表
第一章 脑心肌炎病毒和病毒蛋白参与免疫应答的研究进展
1 脑心肌炎病毒
1.1 EMCV的来历和分类
1.2 EMCV病毒特征和基因组结构
1.3 EMCV病毒蛋白
1.4 EMCV病毒衣壳的三维结构
1.5 EMCV病毒周期
1.5.1 病毒吸附和进入
1.5.2 病毒翻译
1.5.3 EMCV病毒多聚蛋白裂解
1.5.4 EMCV病毒复制
1.5.5 EMCV病毒组装和释放
2 抗病毒信号转导途径及EMCV免疫学研究
2.1 RLRs/MAVS信号途径
2.2 JAK/STATs信号途径
2.3 EMCV免疫逃逸机制
3 本研究的目的和意义
第二章 EMCV VP2 蛋白对病毒体外增殖的作用研究
1 实验材料
1.1 细胞、质粒和病毒
1.2 主要试剂
1.3 主要试剂的配制
1.4 主要仪器设备
2 实验方法
2.1 细胞复苏与培养
2.2 EMCV培养与扩增
2.3 HEK293细胞瞬时转染及EMCV感染
2.4 EMCV结构蛋白VP1、VP2和VP3真核表达载体构建
2.4.1 EMCV病毒RNA提取
2.4.2 EMCV病毒RNA反转录cDNA
2.4.3 EMCV VP1、VP2和VP3基因PCR扩增
2.4.4 VP1、VP2和VP3重组质粒构建及双酶切验证
2.4.5 VP1、VP2和VP3重组表达质粒提取及其在HEK293细胞中的表达
2.5 VP2对细胞的毒性实验检测
2.6 实时荧光定量PCR检测EMCV拷贝数
2.7 TCID50检测EMCV毒价
2.8 ELISA检测VP2对IFN-β表达的影响
2.9 VP2对EMCV介导的IFN-β及JAK/ STAT通路相关因子转录的影响
2.9.1 qPCR检测EMCV感染HEK293细胞中IFN-βmRNA
2.9.2 qPCR检测IFN-β及JAK/ STAT通路相关因子mRNA表达
2.10 VP2蛋白对RLRs通路相关因子表达的影响
2.11 统计学分析
3 实验结果
3.1 EMCV结构蛋白真核表达载体构建及验证
3.2 EMCV结构蛋白促进病毒体外增殖
3.3 VP2抑制EMCV诱导的IFN-β产生及JAK/STAT信号通路下游因子转录
3.4 EMCV VP2抑制病毒诱导的RLRs信号通路蛋白表达
4 小结
第三章 EMCV VP2 蛋白对RLRs信号通路的调控作用研究
1 实验材料
1.1 细胞、质粒和病毒
1.2 主要试剂
1.3 主要试剂的配制
1.4 主要仪器设备
2 实验方法
2.1 EMCV VP2对Poly(I:C)介导的RLRs通路相关因子表达的影响
2.1.1 细胞培养与转染
2.1.2 细胞总RNA提取及反转录cDNA
2.1.3 qPCR检测IFN-β及RLRs通路相关因子mRNA
2.1.4 ELISA检测HEK293细胞中IFN-β表达
2.2 EMCV VP2对Poly(I:C)诱导的IRF3和STAT1磷酸化和核转移的影响
2.3 EMCV VP2对外源MDA5、MAVS、TBK1和IRF3诱导IFN-β转录和表达的影响
2.4 EMCV VP2对MDA5、MAVS、TBK1和IRF3诱导RLRs通路关键蛋白表达的影响
2.5 统计学分析
3 实验结果
3.1 EMCV VP2抑制Poly(I:C)诱导的RLRs信号通路相关因子mRNA
3.2 EMCV VP2抑制Poly(I:C)诱导的信号通路中IRF3和STAT1的磷酸化
3.3 EMCV VP2抑制RLRs通路关键蛋白诱导的IFN-β转录和表达
3.4 EMCV VP2抑制RLRs通路关键蛋白诱导的RLRs蛋白的表达
4 小结与讨论
第四章 EMCV VP2蛋白与RLRs信号通路关键蛋白的相互作用研究
1 实验材料
1.1 细胞及质粒
1.2 主要试剂
1.3 主要试剂的配制
1.4 主要仪器设备
2 实验方法
2.1 激光共聚焦显微镜观察VP2蛋白与RLRs信号通路关键蛋白的共定位分析
2.1.1 细胞培养与转染
2.1.2 IFA实验及激光共聚焦显微镜观察照像
2.2 免疫共沉淀Co-IP检测VP2蛋白与RLRs信号通路关键蛋白的相互作用
2.2.1 细胞培养与转染
2.2.2 Co-IP实验
2.3 蛋白酶体途径抑制剂MG132处理对VP2抑制RLRs信号通路关键蛋白的影响
3.实验结果
3.1 激光共聚焦验证VP2蛋白与MDA5、MAVS、TBK1和IFR3蛋白共定位
3.2 Co-IP验证VP2蛋白与MDA5、MAVS和TBK1蛋白相互作用
3.3 VP2通过蛋白酶体途径抑制RLRs信号通路关键蛋白的表达
4 小结与讨论
第五章 全文总结
参考文献
致谢
附录
作者简介
硕士期间主持的科研项目
硕士期间发表的论文
本文编号：3740139
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3740139.html
