CRISPR/Cas9基因编辑系统介导的多基因敲除滩羊的制备与评价

发布时间：2023-02-14 11:05

　　借助于高通量测序技术、GWAS等组学分析技术,挖掘与家畜优良经济性状及抗逆性状相关的功能基因,进而在常规育种方法技术的基础上,利用分子育种技术,加快育种进程,提高家畜育种水平,变得愈来愈具有可能。特别是近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展与应用,使得育种者在家畜基因组上定点、精确、高效地进行特定基因的精准编辑,从而使得动物的表型向着人们期望的目标变化成为现实。同时,有可能实现多个基因的同时定点精准编辑,在表型上实现聚合效应,缩短育种周期,提高育种效果。本研究在细胞水平、胚胎水平首先分别验证了CRISPR/Cas9基因编辑系统的基因敲除效率,之后,通过将Cas9 mRNA与6条分别针对MSTN、ASIP和BCO2三个基因CDS区的靶向sgRNA同时注射到1细胞期受精卵的胞质中,经体外培养与胚胎移植,成功获得了多基因敲除滩羊,并对基因敲除羊的敲除情况、脱靶效应、遗传性以及表型进行了系统分析。主要研究结果如下:1.成纤维细胞上的编辑效率验证。分别针对每个基因的CDS区设计两个sgRNA,构建细胞表达载体,与Cas9细胞表达载体共同转染成纤维细胞。对比单sgRNA敲除策略和双sgR...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 CRISPR/Cas9系统的起源
        1.1.1 CRISPR/Cas系统
        1.1.2 基因编辑原理与技术
    1.2 CRISPR/Cas9系统的建立
    1.3 CRISPR/Cas9系统的缺陷
    1.4 CRISPR/Cas9系统的应用
        1.4.1 利用CRISPR/Cas9实现基因编辑
        1.4.2 dCas9
        1.4.3 利用CRISPR/Cas9进行高通量筛选
        1.4.4 CRISPR/Cas9的其他应用
    1.5 CRISPR/Cas9系统在动物遗传育种方面的应用
        1.5.1 提供相关疾病模型
        1.5.2 提高动物生产性能
    1.6 研究目的与意义
第二章 CRISPR/Cas9基因编辑系统介导的多基因敲除滩羊的制备与评价
    2.1 材料方法
        2.1.1 试验动物
        2.1.2 构建sgRNA的细胞表达载体
        2.1.3 利用T7EI酶切分析检测细胞
        2.1.4 T-A单克隆测序鉴定突变基因型
        2.1.5 Off-target检测
        2.1.6 Cas9 mRNA的体外转录
        2.1.7 sgRNA的体外转录
        2.1.8 受精卵胞质注射及胚胎移植
        2.1.9 胚胎基因敲除效率检测
        2.1.10 羔羊基因敲除效率检测
        2.1.11 基因敲除滩羊组织基因敲除情况检测
        2.1.12 基因敲除滩羊Off-target检测
        2.1.13 基因敲除滩羊遗传性分析
        2.1.14 免疫荧光分析
        2.1.15 BCO2基因敲除滩羊脂肪颜色鉴定
        2.1.16 BCO2基因敲除滩羊脂肪组织靶基因基因分型及转录情况分析
        2.1.17 蛋白质印迹分析
        2.1.18 H&E染色
        2.1.19 透射电镜分析
        2.1.20 滩羊羔羊的体重测定
        2.1.21 滩羊羔羊的血液生化指标检测
    2.2 结果与分析
        2.2.1 细胞基因敲除效率验证
        2.2.2 胚胎基因敲除效率验证
        2.2.3 个体基因敲除效率验证
        2.2.4 基因敲除滩羊组织敲除情况分析
        2.2.5 基因敲除滩羊脱靶效应检测
        2.2.6 基因敲除雄性羔羊遗传性分析
        2.2.7 基因敲除滩羊的表型分析
    2.3 讨论
    2.4 研究结论
    2.5 创新点
    2.6 下一步的研究内容
参考文献
附录
致谢
作者简介



本文编号：3742489