Lpa-miR-nov-66在羊驼黑色素细胞中的作用研究

发布时间：2023-02-15 14:57

　　microRNAs (miRNAs)在调控哺乳动物黑色素生成和毛色方面具有重要的作用,在不同毛色羊驼皮肤miRNA的表达谱分析中,发现一个新的miRNA(命名为lpa-miR-nov-66),并呈差异表达。经预测,soluble guanylate cyclase (sGC)是lpa-miR-nov-66的靶基因之一。本实验为了研究lpa-miR-nov-66与羊驼黑色素细胞产生黑色素之间的相关性,通过构建lpa-miR-nov-66表达载体,用双荧光报告载体验证了lpa-miR-nov-66的靶基因(sGC)；将lpa-miR-nov-66转染羊驼黑色素细胞,应用实时荧光定量PCR、Western blotting、ELASA等方法对转染后黑色素细胞内相关基因和蛋白的表达水平进行检测,主要实验结果如下： 1实时荧光定量PCR技术检测sGC, MITF, TYR, TYRP1基因mRNA表达水平。结果显示：sGC基因在lpa-miR-nov-66转染组中的mRNA表达水平是对照组的5.83倍,MITFmRNA在转染组和对照组中的差异不显著,TYR在转染组中的mRNA表达水平是对照组的0...

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【学位级别】：硕士

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摘要
前言
文献综述
    1. 黑色素细胞的发育与功能
        1.1 黑色素细胞的发育
        1.2 黑色素细胞的功能
        1.3 黑色素的合成路径
        1.4 有关黑色素生成的信号转导途径
        1.5 影响色素形成的主效基因
    2 miRNAs的研究现状及其在毛色中的应用
        2.1 RNA干扰作用和miRNA的发现
        2.2 miRNA生物发生机制
        2.3 miRNA的功能
材料和方法
    1 实验材料
        1.1 实验样本
        1.2 实验所用仪器
        1.3 细胞培养所需试剂与耗材
        1.4 构建lpa-miR-nov-66过表达载体,靶基因sGC扩增和双荧光报告载体所需试剂和耗材
        1.5 总RNA的提取,RT-PCR,qRT-PCR所需试剂
        1.6 总蛋白的提取及免疫蛋白印迹技术所需试剂
    2 实验方法
        2.1 细胞培养
        2.2 lpa-miR-nov-66过表达载体质粒的构建,靶基因sGC的筛选以及靶基因sGC双荧光报告载体的构建
        2.3 双荧光报告载体和lpa-miR-nov-66表达载体共转染293T细胞检测荧光信号
        2.4 黑色素细胞总RNA的提取
        2.5 蛋白免疫印迹实验方法
        2.6 cAMP和cGMP含量的测定
        2.7 黑色素含量的测定
实验结果
    1. lpa-miR-nov-66在不同毛色羊驼皮肤中的表达量
    2. sGC扩增序列和预测位点结果
    3. lpa-miR-nov-66转染羊驼黑色素细胞的表达量变化
        3.1 转染lpa-miR-nov-66羊驼黑色素细胞总RNA的质量检测
        3.2 lpa-miR-nov-66转染羊驼黑色素细胞后lpa-miR-nov-66表达水平
        3.3 lpa-miR-nov-66转染羊驼黑色素细胞后sGC,MITF,TYR,TYRP1基因表达水平
    4. lpa-miR-nov-66转染羊驼黑色素细胞后sGC,MITF,TYR和TYRP1蛋白表达水平
    5. lpa-miR-nov-66转染羊驼黑色素细胞后黑色素含量的检测
    6. lpa-miR-nov-66转染羊驼黑色素细胞后对cAMP和cGMP的影响结果
    7. 双荧光表达载体转染293T细胞验证靶基因
讨论
全文结论
参考文献
Abstract
中英文对照表及縮写表
致谢



本文编号：3743396