副猪嗜血杆菌自转运蛋白AT2-PD与血清抗性的相关性研究

发布时间：2023-02-19 12:53

　　副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是全世界养猪业出现的导致新生仔猪死亡的主要病原之一,近年来,副猪嗜血杆菌杆菌病已经给全世界养猪业带来巨大经济损失。HPS可作为一种常在菌定殖在猪体的上呼吸道,但是在特定条件下可以侵入机体并且导致严重的全身性疾病,以纤维素性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征,但是参与全身感染的毒力因子及其致病机制仍旧没有研究清楚。 自转运蛋白是革兰氏阴性菌V型分泌系统分泌的蛋白,研究发现它可以抑制细胞的吞噬作用以及抵抗补体介导的杀伤,帮助菌体克服宿主的天然免疫。HPS中已发现与毒力相关的三聚体自转运蛋白(VtaA),发现其在HPS中表现出多样性,并且是很好的疫苗候选抗原。 为了研究自转运蛋白在抵抗补体介导的杀伤即血清抗性方面可能起到的作用,本论文以副猪嗜血杆菌SH0165中发现的自转运蛋白基因at2为研究对象,将at2基因进行缺失,然后利用野生菌株和基因缺失株一同进行血清杀菌试验,来探究at2基因在HPS血清抗性中的作用。具体内容如下： 1电转化法筛选at2-pd基因缺失株 根据同源重组的原理将at2基因的passenger domain即at2...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略词(Abbreviation)
1 文献综述
    1.1 副猪嗜血杆菌研究进展
        1.1.1 副猪嗜血杆菌简介
        1.1.2 副猪嗜血杆菌毒力因子研究进展
    1.2 自转运蛋白研究进展
        1.2.1 自转运蛋白结构和功能
        1.2.2 副猪嗜血杆菌的自转运蛋白
    1.3 血清抗性研究进展
        1.3.1 血清抗性机制研究进展
        1.3.2 HPS血清抗性研究进展
2 研究目的与意义
3 材料与方法
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌株,质粒载体和健康猪血清
        3.1.2 试剂和试剂盒
        3.1.3 培养基及抗生素的配制
        3.1.4 主要溶液的配制
        3.1.5 引物
        3.1.6 主要仪器
    3.2 试验方法
        3.2.1 副猪嗜血杆菌的培养及基因组的提取
        3.2.2 基因克隆程序
        3.2.3 蛋白的原核表达、纯化及SDS-PAGE检测
        3.2.4 健康猪血清的制备
        3.2.5 电转化法筛选at2基因缺失株
        3.2.6 结合转移法筛选at2基因缺失株
        3.2.7 自然转化法筛选at2基因缺失株
        3.2.8 at2基因缺失株的鉴定
        3.2.9 生长曲线绘制
        3.2.10 血清杀菌试验
4 结果与分析
    4.1 电转化法筛选at2-pd基因缺失株
        4.1.1 重组质粒pSHK3^TS-at2-pd-UD的构建
        4.1.2 重组质粒电转入SH0165中
        4.1.3 用重组温敏型质粒筛选at2-pd基因缺失突变株
    4.2 HS1073体外加入AT2-PD蛋白进行血清杀菌试验
        4.2.1 SH0165和HS1073的血清抗性
        4.2.2 AT2-PD蛋白的原核表达、纯化及SDS-PAGE检测
        4.2.3 确定血清的最佳杀菌浓度
        4.2.4 确定试验用AT2-PD蛋白的最适浓度
        4.2.5 AT2-PD蛋白对HS1073菌株血清抗性有提高作用
    4.3 其他方法筛选at2基因缺失株
        4.3.1 接合转移法筛选
        4.3.2 自然转化法筛选
    4.4 基因缺失株的鉴定
        4.4.1 PCR鉴定
        4.4.2 缺失株at2-pd基因测序
        4.4.3 Western blot鉴定
        4.4.4 Southern blot鉴定
    4.5 生长曲线的绘制
    4.6 缺失株和野生株进行血清杀菌试验
5 讨论
    5.1 at2基因缺失株的筛选
        5.1.1 电转化法温敏质粒筛选
        5.1.2 接合转移法筛选
        5.1.3 自然转化法筛选
    5.2 体外加入AT2-PD蛋白进行血清杀菌试验
    5.3 缺失株和野生株进行血清杀菌试验
6 结论
参考文献
附录
致谢



本文编号：3746258