H3N2犬流感病毒M1蛋白胞内抗体的制备及活性研究

发布时间：2023-02-21 18:15

　　犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)属于正黏病毒科甲型流感病毒属,能感染犬引发犬流感,出现轻度咳嗽、流涕等轻度症状,以及高烧、呼吸急促、脓性鼻涕、厌食、抑郁和出血性肺炎等重度症状。目前,流行病学研究证实马源H3N8和禽源H3N2亚型犬流感病毒能够在犬类中稳定传播,流感病毒成功的实现由马到犬、由禽到犬的跨种间传播,犬逐渐成为流感病毒进化和繁衍的“温床”。犬作为人类的伴侣动物,在现代人类生活中具有特殊的地位,犬作为流感病毒的中间宿主存在着将病毒传染给人类的潜在风险,将给人类健康带来巨大的威胁。由于流感病毒易发生抗原漂移和抗原转移,针对病毒表面抗原的中和抗体及疫苗需要不断更新,疫苗的时效性存在很大的问题,因此通用型犬流感病毒抗体药物的研究迫在眉睫。本研究以流感病毒高度保守的M1蛋白为靶标,通过噬菌体抗体库筛选特异性抗M1蛋白的scFv,并对scFv进行免疫结合活性和生物学活性研究;然后将利用具有高效跨膜转导功能的TAT蛋白构建TAT-scFv穿梭胞内抗体,在细胞水平和SPF鸡胚中评价胞内抗体对A/Canine/Guangdong/05/2011(H3N2)、A/...

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摘要
Abstract
第一篇 文献综述
    第一章 犬流感病毒的研究进展
        1.1 病原学特征
        1.2 流行病学
            1.2.1 H3N8 亚型犬流感病毒
            1.2.2 H3N2 亚型犬流感病毒
            1.2.3 H3N8和H3N2 亚型犬流感病毒地理分布
        1.3 发病
            1.3.1 感染途径
            1.3.2 病毒复制
            1.3.3 孵化和脱落期
        1.4 临床症状
        1.5 诊断
            1.5.1 临床诊断
            1.5.2 血清学诊断
            1.5.3 分子生物学诊断
        1.6 预防
            1.6.1 病毒灭活疫苗
            1.6.2 减毒活疫苗
            1.6.3 病毒样颗粒疫苗
        1.7 治疗
        1.8 公共卫生
        1.9 展望
第二篇 研究内容
    第一章 H3N2 犬流感病毒M1 蛋白的原核表达及鉴定
        1.1 材料
            1.1.1 病毒、质粒和菌种
            1.1.2 主要试剂
            1.1.3 实验动物
            1.1.4 主要仪器
            1.1.5 溶液配制
        1.2 方法
            1.2.1 引物设计与合成
            1.2.2 M1 基因的扩增及目的片段回收
            1.2.3 重组表达质粒的构建
            1.2.4 感受态细胞的制备和转化
            1.2.5 重组质粒p ET-SUMO-M1 的鉴定及转化
            1.2.6 目的蛋白M1 的诱导表达及表达鉴定
            1.2.7 表达产物的初步纯化
            1.2.8 纯化产物的Western blot鉴定
            1.2.9 目的蛋白的精纯
            1.2.10 M1 蛋白多抗的制备及效价测定
            1.2.11 目的蛋白的Western blot鉴定
        1.3 结果
            1.3.1 M1 基因的扩增
            1.3.2 重组表达质粒p ET-SUMO-M1 的构建及PCR鉴定
            1.3.3 目的蛋白诱导表达及可溶性分析
            1.3.4 重组融合蛋白的纯化和Western blot分析
            1.3.5 目的蛋白的纯化
            1.3.6 M1 蛋白多抗的制备
            1.3.7 纯化的目的蛋白的Western blot分析
        1.4 讨论
        1.5 小结
    第二章 抗犬流感病毒H3N2-M1 scFv的筛选及活性研究
        2.1 材料
            2.1.1 主要材料
            2.1.2 溶液配制
        2.2 方法
            2.2.1 噬菌体抗体库Tomlison I+J次级抗体库制备
            2.2.2 抗H3N2-M1 单链抗体的筛选
            2.2.3 抗H3N2-M1 单链抗体的表达
            2.2.4 抗H3N2-M1 阳性菌株ELISA检测
            2.2.5 抗H3N2-M1 阳性菌株PCR鉴定及测序
            2.2.6 抗H3N2-M1-sc Fv的纯化
            2.2.7 scFv的 WB鉴定和免疫结合活性分析
            2.2.8 细胞水平sc Fv的活性研究
            2.2.9 SPF鸡胚中sc Fv的活性研究
        2.3 结果
            2.3.1 次级噬菌体抗体库的扩增结果
            2.3.2 文库筛选结果
            2.3.3 阳性菌株筛选和PCR鉴定结果
            2.3.4 抗H3N2-M1 阳性菌株序列分析
            2.3.5 抗H3N2-M1 单链抗体的纯化
            2.3.6 scFv的 WB鉴定和免疫结合活性分析
            2.3.7 细胞水平sc Fv的活性研究
            2.3.8 SPF鸡胚中sc Fv的活性研究
        2.4 讨论
            2.4.1 scFv的筛选
            2.4.2 scFv的纯化
            2.4.3 scFv的活性研究
        2.5 小结
    第三章 TAT-scFv重组穿梭胞内抗体的制备及活性研究
        3.1 材料
            3.1.1 细菌、细胞及病毒
            3.1.2 主要试剂和仪器
        3.2 方法
            3.2.1 引物设计与合成
            3.2.2 scFv基因的扩增及目的片段回收
            3.2.3 scFv基因和质粒pMD-18T的连接
            3.2.4 pMD-18T-scFv质粒和pET-28(a)-TAT质粒的双酶切、回收及连接
            3.2.5 感受态细胞的制备和转化
            3.2.6 pET-28(a)-TAT-scFv重组质粒的PCR及双酶切鉴定
            3.2.7 TAT-scFv重组表达菌的制备
            3.2.8 目的蛋白TAT-scFv的诱导表达及鉴定
            3.2.10 TAT-scFv表达菌的中试发酵
            3.2.11 TAT-scFv重组蛋白的初步纯化
            3.2.12 TAT-scFv重组蛋白的精纯
            3.2.13 TAT-scFv的 WB鉴定和免疫结合活性分析
            3.2.14 细胞水平TAT-scFv的活性研究
            3.2.15 SPF鸡胚中sc Fv的活性研究
        3.3 结果
            3.3.1 scFv基因的扩增
            3.3.2 pET-28(a)-TAT-scFv重组质粒的PCR及双酶切鉴定
            3.3.3 重组蛋白TAT-scFv的诱导表达及可溶性分析
            3.3.4 重组菌表达条件的优化结果
            3.3.5 TAT-scFv重组蛋白的初步纯化
            3.3.6 TAT-scFv重组蛋白的精纯
            3.3.7 TAT-scFv的 WB鉴定和免疫结合活性分析
            3.3.8 细胞水平TAT-scFv重组穿梭胞内抗体的活性研究
            3.3.9 SPF鸡胚中TAT-scFv的活性研究
        3.4 讨论
            3.4.1 TAT细胞跨膜蛋白
            3.4.2 TAT-scFv对三种H3N2 流感病毒抑制作用
        3.5 小结
结论
参考文献
作者简介
致谢



本文编号：3747768