鸡腺胃炎病原的分离及Real-time PCR检测IBV在各器官的表达

发布时间：2023-02-25 20:47

　　2011-2012年肉鸡和蛋鸡腺胃炎发病率较高，该病在中国大部分省份均有发生和流行，给养鸡业造成了严重的经济损失。加强对该病检测方法的研究，对控制传染性病毒性腺胃炎病的发生，保护和促进养鸡业的健康发展具有重要意义。自腺胃炎发生以来，关于腺胃炎的病因仍然众说纷纭，本研究在临床上遇到的传染性病毒性腺胃炎病例中分离出了传染性支气管炎病毒（IBV）。不同发病程度的患病鸡的剖检变化不同，对于病因不详的病毒性疾病，弄清楚病毒侵害的主要靶器官对于该病的预防和治疗起着至关重要的作用。因此笔者应用实时荧光定量PCR的方法对患病鸡的胸腺、肺脏、心脏、腺胃、肾脏、肝脏、脑等器官中病毒的含量做定量分析并进行差异显著性分析。 将连续盲传八代的尿囊液进行直接血凝试验，病毒无血凝性，用1%磷脂酶C处理后有血凝性。也通过对NDV的干扰实验及RTPCR实验初步鉴定该病毒为传染性支气管炎病毒。首先针对IBV-N基因序列设计了一对特异性引物，进行RT-PCR反应，扩增出216bp的目的片段，同时参照已往发表的文献合成一对扩增内参基因的β-actin引物，大小为139bp。将这两个扩增的目的片段分别与pEASY-T1Clon...

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【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
前言
    1.1 致病因素
        1.1.1 非传染性因素
        1.1.2 传染性因素
            1.1.2.1 国外研究进展
            1.1.2.2 国内研究进展
    1.2 与传染性病毒性腺胃炎相关的主要病原
        1.2.1 禽网状内皮增生症病毒
        1.2.2 冠状病毒
        1.2.3 禽呼肠孤病毒
        1.2.4 马立克氏病毒
    1.3 流行病学
    1.4 临床症状
    1.5 病理组织学变化
        1.5.1 腺胃
        1.5.2 十二指肠
        1.5.3 法氏囊
        1.5.4 肾脏
        1.5.5 胸腺
    1.6 诊断
    1.7 治疗
    1.8 实时荧光定量 PCR
        1.8.1 实时荧光定量 PCR 的分类
            1.8.1.1 SYBR GreenI 荧光染料法
            1.8.1.2 TaqMan 探针法
            1.8.1.3 双杂交探针
            1.8.1.4 分子信标
        1.8.2 实时荧光定量 PCR 的定量方法
            1.8.2.1 绝对定量
            1.8.2.2 相对定量
        1.8.3 实时荧光定量 PCR 的应用
            1.8.3.1 分子生物学应用
            1.8.3.2 遗传学
            1.8.3.3 甲基化分析
            1.8.3.4 SNP 分析
            1.8.3.5 临床食品及环境的应用
            1.8.3.6 肿瘤基因检测
            1.8.3.7 产前诊断
        1.8.4 荧光定量 PCR 的优点
    1.9 研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 毒株
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 主要溶液及其配制
        2.2.2 病毒的分离
        2.2.3 血凝试验(HA)
        2.2.4 鸡胚半数致死量试验
        2.2.5 病毒对 NDV 的干扰试验
        2.2.6 石蜡切片制作方法
        2.2.7 HE 染色
        2.2.8 IBV 的引物设计及目的片段扩增
        2.2.9 重组质粒的构建
            2.2.9.1 动物组织 RNA 的提取
            2.2.9.2 反转录反应
            2.2.9.3 PCR 反应
            2.2.9.4 PCR 产物的胶回收
            2.2.9.5 PCR 产物与 pEASY-T1 Cloning Vector 的连接反应
            2.2.9.6 大肠杆菌感受态细胞（E.coli DH5α）的制备
            2.2.9.7 连接产物的转化
            2.2.9.8 质粒 DNA 的提取
            2.2.9.9 重组质粒 DNA 的鉴定
                2.2.9.9.1 质粒酶切鉴定
                2.2.9.9.2 PCR 鉴定
            2.2.9.10 阳性克隆序列测定
        2.2.10 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR 的建立
            2.2.10.1 质粒标准品的制备及原始定量
            2.2.10.2 荧光定量 PCR 反应条件的优化
            2.2.10.3 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR 的反应体系及程序
            2.2.10.4 标准曲线的建立
            2.2.10.5 临床样品检测
                2.2.10.5.1 临床样品组织中 RNA 的提取
                2.2.10.5.2 反转录反应
                2.2.10.5.3 实时荧光定量 PCR 检测不同器官的病毒拷贝量
3. 结果
    3.1 病毒的分离与鉴定
        3.1.1 病毒的分离与传代
        3.1.2 血凝实验结果
        3.1.3 鸡胚半数致死量试验结果
        3.1.4 病毒对 NDV 的干扰试验
        3.1.5 病理组织学变化
    3.2 PCR 实验结果
    3.3 阳性质粒测序结果
    3.4 荧光定量 PCR 反应条件的优化
    3.5 荧光定量 PCR 检测β-actin、N 基因标准曲线的建立
    3.6 临床样品的检测结果
    3.7 SPSS 17.0 软件 Duncan 法对各器官病毒含量进行差异显著性分析结果
4. 讨论
5 结论
参考文献
致谢
研究生期间发表论文



本文编号：3749168