Ⅲ型分泌系统2效应因子及双组分系统CpxR对禽致病性大肠杆菌毒力的影响

发布时间：2023-02-26 01:26

　　禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)可引起家禽严重的呼吸道感染和全身性疾病,严重威胁家禽业的健康发展。另外,APEC属于肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic E.coli,ExPEC),其与人源ExPEC具有高度的同源性及相似的致病机制,可作为毒力基因与耐药基因的储库,具有潜在的公共卫生意义。在感染过程中,APEC一方面通过分泌系统发挥作用,另一方面通过调控系统控制毒力因子适时表达,促进其生存及致病。分泌系统是致病菌进化过程中形成的特定毒力因子,其可通过分泌效应因子扰乱宿主免疫应答反应,从而发挥致病作用。病原菌通过双组分系统感应外界环境,进而调控基因适时表达,促进其生存及致病。本实验室前期研究表明,大肠杆菌III型分泌系统2(E.coli Type III secretion system 2,ETT2)和Ⅵ型分泌系统2(TypeⅥsecretion system 2,T6SS2)存在并参与APEC的胞内存活、菌间竞争能力等致病过程。然而,ETT2效应因子的致病作用及T6SS2的调控机制尚...

【文章页数】：81 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
主要符号对照表
第一章 绪论
    1.1 禽致病性大肠杆菌概述
    1.2 禽致病性大肠杆菌的危害
    1.3 禽致病性大肠杆菌的毒力因子
        1.3.1 T3SS概述
        1.3.2 T3SS与细菌毒力的关系
        1.3.3 T3SS的效应因子
        1.3.4 ETT2概述
        1.3.5 ETT2对细菌毒力的影响
        1.3.6 APEC T6SS概述
        1.3.7 Cpx双组分系统
    1.4 禽致病性大肠杆菌的防治
        1.4.1 环境控制
        1.4.2 提高机体免疫
        1.4.3 药物治疗
第二章 禽致病性大肠杆菌ETT2效应因子的筛选及鉴定
    2.1 材料和方法
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 试验主要试剂
        2.1.3 主要仪器设备
        2.1.4 引物设计
        2.1.5 eivC基因缺失株的构建及鉴定
        2.1.6 生长曲线测定
        2.1.7 RNA提取
        2.1.8 qPCR检测基因的相对转录水平
        2.1.9 分泌蛋白的提取
        2.1.10 分泌蛋白的蛋白质组学分析
        2.1.11 疑似效应因子的功能预测
        2.1.12 ETT2效应因子的验证
        2.1.13 效应因子EspE3表达与纯化
        2.1.14 效应因子EspE3体外泛素化试验
    2.2 结果
        2.2.1 eivC基因缺失株的构建
        2.2.2 生长曲线测定
        2.2.3 ETT2核心基因不同时间的转录水平分析
        2.2.4 分泌蛋白的提取及质谱分析
        2.2.5 分泌蛋白的生物信息学分析
        2.2.6 ETT2 效应因子Esp E3 的验证
        2.2.7 效应因子EspE3的表达及纯化
        2.2.8 EspE3的E3泛素连接酶活性检测
    2.3 讨论
第三章 ETT2 效应因子Esp E3 对禽致病性大肠杆菌毒力的影响
    3.1 材料和方法
        3.1.1 菌株、细胞系、质粒
        3.1.2 试验动物
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 主要仪器设备
        3.1.5 引物设计
        3.1.6 效应因子espE3基因缺失株构建
        3.1.7 效应因子espE3基因互补株构建
        3.1.8 效应因子真核表达载体构建
        3.1.9 生长曲线及运动性测定
        3.1.10 细胞黏附及侵袭试验
        3.1.11 致病性测定
        3.1.12 体内载菌量测定
        3.1.13 细胞因子转录水平检测
        3.1.14 GST-Esp E3 融合蛋白表达及纯化
        3.1.15 GST pull-down筛选Esp E3 的宿主互作蛋白
        3.1.16 统计学分析
    3.2 结果
        3.2.1 ETT2 效应因子EspE3 基因缺失株与互补株构建
        3.2.2 真核表达质粒构建
        3.2.3 生长曲线与运动性测定
        3.2.4 细胞黏附及侵袭
        3.2.5 致病力测定
        3.2.6 体内载菌量测定
        3.2.7 细胞因子检测
        3.2.8 GST-EspE3 蛋白表达与纯化结果
        3.2.9 GST pull-down筛选ETT2 效应因子EspE3 的宿主互作蛋白
    3.3 讨论
第四章 双组分系统CpxR调控T6SS2 促进禽致病性大肠杆菌毒力的分子机制
    4.1 材料和方法
        4.1.1 菌株和质粒
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要仪器设备
        4.1.4 引物设计
        4.1.5 缺失株和互补株的构建
        4.1.6 过表达菌株的构建
        4.1.7 生长曲线与运动性测定
        4.1.8 生物被膜测定
        4.1.9 药物敏感性测定
        4.1.10 血清杀菌试验
        4.1.11 细菌竞争能力测定
        4.1.12 细胞黏附及侵袭试验
        4.1.13 致病性测定
        4.1.14 体内载菌量测定及体内竞争能力测定
        4.1.15 qRT-PCR检测基因的相对转录水平
        4.1.16 免疫印迹试验
        4.1.17 启动子活性检测
        4.1.18 CpxR的克隆表达及纯化
        4.1.19 凝胶迁移试验(EMSA)
        4.1.20 统计学分析
    4.2 结果
        4.2.1 cpxR基因缺失株及互补株构建
        4.2.2 生长曲线测定
        4.2.3 运动性测定
        4.2.4 生物被膜形成能力
        4.2.5 药物敏感性测定
        4.2.6 抗血清杀菌能力
        4.2.7 菌间竞争能力测定
        4.2.8 细胞黏附及侵袭
        4.2.9 APEC致病力测定
        4.2.10 体内载菌量测定
        4.2.11 体内竞争能力测定
        4.2.12 APEC中 T6SS2 的转录与表达
        4.2.13 hcp2B启动子活性检测
        4.2.14 CpxR在 hcp2B启动区域上结合位点预测
        4.2.15 CpxR蛋白表达与纯化
        4.2.16 CpxR直接与hcp2B启动子区域结合
    4.3 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历



本文编号：3749535