牛巴贝斯虫病ELISA检测方法的建立
发布时间：2023-03-02 19:40
牛巴贝斯虫病(Bovine babesiosis)，是由媒介蜱传播的巴贝斯属的多种病原引起的血液原虫病，临床主要表现为高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿，严重感染时引起死亡。本病在世界范围内广泛流行，给家畜及畜产品国际贸易带来严重危害，直接影响经济的发展。在我国，业已报道的牛的巴贝斯虫病的病原有双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、大巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种以及东方巴贝斯虫共6种，其中牛巴贝斯虫与双芽巴贝斯虫的发病率和致死率最高，危害严重，而两者均以牛蜱属的蜱种为媒介，临床上常常表现为混合感染，目前尚无有效可行的血清学诊断方法可特异性地检测牛巴贝斯虫的感染。本研究以牛巴贝斯虫为研究对象，采用原核表达系统克隆表达了牛巴贝斯虫RAP-1的C端蛋白，并以此蛋白为抗原建立了ELISA鉴别检测方法，并对我国13个省牛巴贝斯虫病的流行情况进行了血清学调查。现将研究内容总结如下： 1.利用原核表达载体pGEX-4T-1构建重组质粒，在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中成功地表达获得了RAP-1基因的C端肽段即BORCT。融合蛋白以GST为标签，可溶性表达量为1.51mg/mL，Western-blo...
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 引言
1.1 病原学特征
1.2 生活史
1.3 病理学和致病机制
1.4 超微结构
1.5 牛巴贝斯虫的入侵机制
1.6 牛巴贝斯虫的血清学诊断进展
1.6.1 间接荧光抗体试验（INDIRECT FLUORESCENT ANTIBODY TEST，IFAT）
1.6.2 免疫印迹法（WESTERN BLOTTING）
1.6.3 酶联免疫吸附试验（ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY，ELISA）
1.7 研究内容
第二章 牛巴贝斯虫 RAP-1 C 端基因的克隆、表达与鉴定
2.1 材料
2.1.1 主要仪器
2.1.2 主要试剂
2.1.3 虫体与血清
2.1.4 实验动物
2.2 方法
2.2.1 RAP-1 基因的生物信息学分析
2.2.2 引物的设计与合成
2.2.3 RAP -1 基因的 PCR 扩增
2.2.4 RAP-1 基因与 pGEM-T Easy 载体的连接与转化
2.2.5 表达质粒 pBORCT 的构建
2.2.6 BORCT 的诱导表达
2.2.7 重组蛋白的可溶性分析
2.2.8 重组蛋白的纯化
2.2.9 重组蛋白的反应原性的检测
2.3 结果
2.3.1 蛋白区段的生物信息学分析
2.3.2 目的基因的克隆
2.3.3 重组表达菌的诱导表达
2.3.4 重组蛋白的 Western blot 鉴定
2.4 讨论
第三章 重组蛋白 BORCT 的间接 ELISA 方法的建立
3.1 材料
3.1.1 主要仪器
3.1.2 主要试剂
3.1.3 抗原的制备
3.1.4 血清的采集
3.2 方法
3.2.1 间接 ELISA 试验程序
3.2.2 ELISA 最佳反应条件的选择
3.2.3 ELISA 阳性阈值和特异性、敏感性的确定
3.2.4 特异性实验（交叉实验）
3.2.5 抗体动态曲线的评价
3.2.6 野外样品 ELISA 方法的评价
3.3 结果
3.3.1 ELISA 最佳反应条件的选择
3.3.2 ELISA 阳性阈值和异性、敏感性的确定
3.3.3 特异性实验（交叉实验）
3.3.4 抗体动态曲线的评价
3.3.5 野外样品对 ELISA 方法的评价
3.4 讨论
第四章 中国部分地区牛巴贝斯虫的血清流行病学调查
4.1 材料
4.1.1 主要器材
4.1.2 主要试剂
4.1.3 抗原的制备
4.1.4 血清的采集
4.2 方法
4.3 结果
4.4 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3752510
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 引言
1.1 病原学特征
1.2 生活史
1.3 病理学和致病机制
1.4 超微结构
1.5 牛巴贝斯虫的入侵机制
1.6 牛巴贝斯虫的血清学诊断进展
1.6.1 间接荧光抗体试验（INDIRECT FLUORESCENT ANTIBODY TEST，IFAT）
1.6.2 免疫印迹法（WESTERN BLOTTING）
1.6.3 酶联免疫吸附试验（ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY，ELISA）
1.7 研究内容
第二章 牛巴贝斯虫 RAP-1 C 端基因的克隆、表达与鉴定
2.1 材料
2.1.1 主要仪器
2.1.2 主要试剂
2.1.3 虫体与血清
2.1.4 实验动物
2.2 方法
2.2.1 RAP-1 基因的生物信息学分析
2.2.2 引物的设计与合成
2.2.3 RAP -1 基因的 PCR 扩增
2.2.4 RAP-1 基因与 pGEM-T Easy 载体的连接与转化
2.2.5 表达质粒 pBORCT 的构建
2.2.6 BORCT 的诱导表达
2.2.7 重组蛋白的可溶性分析
2.2.8 重组蛋白的纯化
2.2.9 重组蛋白的反应原性的检测
2.3 结果
2.3.1 蛋白区段的生物信息学分析
2.3.2 目的基因的克隆
2.3.3 重组表达菌的诱导表达
2.3.4 重组蛋白的 Western blot 鉴定
2.4 讨论
第三章 重组蛋白 BORCT 的间接 ELISA 方法的建立
3.1 材料
3.1.1 主要仪器
3.1.2 主要试剂
3.1.3 抗原的制备
3.1.4 血清的采集
3.2 方法
3.2.1 间接 ELISA 试验程序
3.2.2 ELISA 最佳反应条件的选择
3.2.3 ELISA 阳性阈值和特异性、敏感性的确定
3.2.4 特异性实验（交叉实验）
3.2.5 抗体动态曲线的评价
3.2.6 野外样品 ELISA 方法的评价
3.3 结果
3.3.1 ELISA 最佳反应条件的选择
3.3.2 ELISA 阳性阈值和异性、敏感性的确定
3.3.3 特异性实验（交叉实验）
3.3.4 抗体动态曲线的评价
3.3.5 野外样品对 ELISA 方法的评价
3.4 讨论
第四章 中国部分地区牛巴贝斯虫的血清流行病学调查
4.1 材料
4.1.1 主要器材
4.1.2 主要试剂
4.1.3 抗原的制备
4.1.4 血清的采集
4.2 方法
4.3 结果
4.4 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3752510
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