牛呼吸道合胞体病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

发布时间：2023-03-07 15:02

　　本研究旨在建立牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)实时荧光定量PCR(RT-qPCR)快速检测方法。通过查阅中外相关文献,设计并筛选出一对引物用于特异性扩增BRSV核衣壳(N)蛋白基因片段。对该目的基因进行克隆和测序后通过体外转录技术制备cRNA,计算体系中RNA的浓度;分装后验证其重复性与稳定性,并借助数字PCR进行联合定值确定参考品的最终浓度;使用该BRSV参考品作为模板,设计引物和探针,通过反应条件的优化,建立了BRSV RT-qPCR快速检测方法,并对其灵敏度、特异性、稳定性和准确性进行评价。结果表明,制备的BRSV参考品定值结果为(1.11±0.04)×10¹¹ 拷贝数/mL。所建立的RT-qPCR快速检测方法能有效鉴定BRSV核酸参考品,最低可检出病毒核酸10⁴拷贝数/mL;与另外8种反刍动物病原均无非特异性扩增,特异性强;对临床样本检测的结果与测序结果一致性达100%。结果显示,本研究建立的BRSV RT-qPCR快速检测方法特异性强、灵敏度高,具有较大的临床应用价...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 病毒来源
    1.2 主要试剂
    1.3 核酸提取
    1.4 BRSV核衣壳(N)蛋白基因的扩增、克隆和序列分析
    1.5 体外转录病毒RNA制备BRSV参考品
    1.6 BRSV RT-qPCR方法的建立和优化
    1.7 特异性试验
    1.8 灵敏度试验
    1.9 重复性试验
    1.10 临床样本检测验证
2 结果
    2.1 BRSV-N基因的扩增、克隆和测序
    2.2 BRSVcRNA参考品的制备与定值
    2.3 BRSV RT-qPCR检测方法的建立和反应条件优化
    2.4 特异性试验
    2.5 灵敏度试验
    2.6 重复性试验
    2.7 临床样本的检测
3 讨论



本文编号：3757543