重组马立克氏病毒及其突变株生物学活性的比较研究
发布时间：2023-03-12 02:21
马立克氏病毒(Marek′s disease virus, MDV)是α疱疹病毒的成员，基因组为180kb左右的双股DNA，可引起鸡的淋巴细胞瘤。GX0101株MDV是国内外从鸡体内分离到的第一株整合有网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus, REV)长末端重复序列(Long terminal repeat, LTR)的重组野毒株。本实验室前期研究中已经构建了GX0101的细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome, BAC)克隆以及敲除REV-LTR的突变株GX0101LTR，证实REV-LTR插入片段显著增强了GX0101的横向传播能力。敲除肿瘤基因meq的突变株GX0101meq病毒不但丧失对SPF鸡的致病性，而且不再引起肿瘤以及胸腺和法氏囊萎缩。本学位论文在上述研究的基础上，进一步构建不同的突变株，并以此深入研究MDV相关的生物学活性和研发MDV的基因缺失疫苗。 1完成了GX0101株MDV的全基因组序列分析 自然重组病毒GX0101在致病性、免疫原性、横向传播能力等方面具有独特的生物学活性。为了对GX...
【文章页数】：167 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
符号说明及缩略词
中文摘要
Abstract
1 前言
1.1 马立克氏病病毒（MDV）的研究进展
1.1.1 病原学
1.1.2 流行病学
1.1.3 病理生物学
1.1.4 诊断技术
1.2 MDV 分子生物学研究进展
1.2.1 MDV 基因组结构
1.2.2 MDV 结构蛋白及相关基因
1.3 禽反转录病毒与 MDV 基因重组的研究进展
1.3.1 MDV 与 REV 间的基因重组
1.3.2 MDV 与 ALV 间的基因重组
1.3.3 REV 与 MDV 基因重组的机制
1.3.4 带有 REV-LTR 的重组 MDV 野毒株 GX0101 流行病学意义
1.4 BAC 技术和同源重组技术在 MDV 研究中的应用
1.4.1 细菌人工染色体载体系统(BAC)
1.4.2 利用 BAC 构建 MDV 感染性克隆
1.4.3 基于 MDV BAC 感染性克隆的同源重组技术
1.5 基因芯片技术在 MDV 研究中的应用
1.5.1 基因芯片的简介
1.5.2 基因芯片的应用
1.6 MD 疫苗研究进展
1.6.1 常规致弱疫苗
1.6.2 新型基因工程疫苗
1.7 本研究的目的及意义
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 常规分子克隆试剂
2.1.2 细胞培养相关试剂
2.1.3 荧光定量相关试剂
2.1.4 多克隆抗体制备相关试剂
2.1.5 Agilent 表达谱芯片相关试剂
2.1.6 主要仪器
2.1.7 相关疫苗及抗原
2.1.8 相关病毒及菌种
2.1.9 病毒增殖与鉴定相关试验材料
2.2 常规试验操作方法
2.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备
2.2.2 MDV 的拯救、鉴定
2.2.3 MDV 的增殖、定量
2.2.4 MDVBAC 质粒的大量制备及电转化
2.2.5 重组蛋白的纯化以及SDS-PAGE 蛋白质电泳
2.2.6 淋巴细胞的分离以及DNA 的提取
2.2.7 病毒RNA 的提取以及反转录
2.3 自然重组马立克氏病毒 GX0101 的全基因组序列的测定和比较分析
2.3.1 GX0101 感染性克隆GX0101-BAC 质粒的制备
2.3.2 GX0101 感染性克隆GX0101-BAC 的测序
2.3.3 GX0101 的全基因组分析
2.4 以 GX0101 构建 meq 基因缺失疫苗候选株及其安全性免疫保护效果的比较研究
2.4.1 利用同源重组技术构建 SC9-1(GX0101Δmeq kana)株 MDV
2.4.2 利用同源重组技术构建SC9-2(GX0101 meq kana BAC)株MDV
2.4.3 SC9-1、SC9-2 株MDV 的拯救、鉴定
2.4.4 SC9-1、SC9-2 株MDV 在细胞上的复制水平
2.4.5 SC9-1、SC9-2 株MDV 对SPF 鸡的安全性
2.4.6 SC9-1 株MDV 在鸡体内的增殖水平
2.4.7 SC9-1、SC9-2 株MDV 对SPF 鸡的免疫保护效果
2.4.8 SC9-1 株MDV 对海兰褐蛋鸡的免疫保护效果
2.4.9 SC9-1 株MDV 对SPF 鸡感染低剂量rMd5 的免疫保护效果
2.5 GX0101 在自然感染传播过程中竞争性选择压优势的模拟分析
2.5.1 用于区分MDVGX0101 和GX0101 LTR 的荧光定量PCR 探针设计
2.5.2 双重荧光定量PCR 探针标准曲线的制备
2.5.3 接种相同剂量GX0101 和GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较
2.5.4 接种不同剂量GX0101 和GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较
2.6 缺失 GX0101 SORF2 基因的重组病毒的构建及其生物学活性比较
2.6.1 鼠抗MDVSORF2 蛋白多克隆抗体制备
2.6.2 敲除SORF2 基因的重组病毒GX0101Δsorf2 的构建
2.6.3 间接免疫荧光试验鉴定重组病毒GX0101Δsorf238
2.6.4 Western blot 对重组病毒GX0101Δsorf2 以及SORF2 蛋白特异性鉴定
2.6.5 GX0101Δsorf2 在CEF 细胞上的复制能力的检测
2.6.6 GX0101Δsorf2 的致病性试验
2.6.7 GX0101Δsorf2 在鸡体内的的病毒血症的检测
2.6.8 GX0101Δsorf2 对SPF 鸡体液免疫应答的影响
2.6.9 GX0101Δsorf2 和GX0101 横向传播能力比较
2.7 插入 ALV-LTR 的重组 MDV 的构建及其生物学活性的比较研究
2.7.1 插入ALV-LTR 片段的重组MDV 的构建
2.7.2 重组MDVGX0101-ALV-LTR 的拯救
2.7.3 GX0101-ALV-LTR 在细胞上的复制能力
2.7.4 间接免疫荧光鉴定GX0101-ALV-LTR SORF2 蛋白的表达
2.7.5 GX0101-ALV-LTR 在CEF 细胞培养的稳定性鉴定
2.7.6 GX0101-ALV-LTR 的致病性检测及鸡体内的稳定性鉴定
2.8 LTR 插入片段对重组病毒的病毒基因表达以及重组病毒对宿主基因表达的影响
2.8.1 不同CEF 细胞感染不同重组病毒的总RNA 提取
2.8.2 样品的RNA 的放大和荧光标记
2.8.3 Agilent 表达谱芯片杂交
2.8.4 Agilent 表达谱芯片扫描
2.8.5 Agilent 表达谱芯片结果的质控检测
2.8.6 重组病毒GX0101、GX0101-ALV-LTR 与GX0101 LTR 的病毒基因差异表达的分析
2.8.7 重组病毒GX0101、GX0101-ALV-LTR 与GX0101 LTR 对宿主基因表达的差异性分析
2.8.8 GX0101 重组REV-LTR 片段对其重组位点后的基因转录水平的影响
3 结果与分析
3.1 GX0101 的全基因组序列的测定和比较分析
3.1.1 GX0101 的基因组结构以及与其它不同株 MDV 的系统进化关系
3.1.2 从 GX0101 全基因组水平比较分析 REV-LTR 插入片段
3.1.3 相对其它毒株 GX0101 基因组中缺失的片段
3.1.4 相对其它毒株 GX0101 基因组中增加的片段
3.1.5 GX0101 基因组的开放阅读框和单核苷酸多态性
3.1.6 GX0101 与英国分离株 C12/130 感染性克隆的基因组差异比较
3.2 以 GX0101 构建 meq 基因缺失疫苗候选株及其安全性免疫保护效果的比较
3.2.1 SC9-1、SC9-2 疫苗候选株的构建和鉴定
3.2.2 SC9-1、SC9-2 株 MDV 拯救鉴定结果
3.2.3 SC9-1、SC9-2 株 MDV 在细胞上的复制能力
3.2.4 SC9-1 株 MDV 在鸡体内的增殖水平
3.2.5 SC9-1、SC9-2 株 MDV 对 SPF 鸡的安全性
3.2.6 SC9-1、SC9-2 株 MDV 对 SPF 鸡的免疫保护效果
3.2.7 SC9-1 株 MDV 对海兰褐蛋鸡的免疫保护效果
3.2.8 SC9-1 株 MDV 对 SPF 鸡感染低剂量 rMd5 的免疫保护效果
3.2.9 SC9-1 疫苗候选株中试产品与 CVI988/Rispens 疫苗的保护性免疫力
3.3 GX0101 在自然感染传播过程中竞争性选择压优势的模拟分析
3.3.1 区分 MDV GX0101 和 GX0101 LTR 的荧光定量 PCR 探针具有良好的特异性
3.3.2 双重荧光定量 PCR 探针标准曲线的制备
3.3.3 接种相同剂量 GX0101 和 GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较
3.3.4 接种不同剂量 GX0101 和 GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较
3.4 缺失 GX0101 SORF2 基因的重组病毒的构建及其生物学活性的研究
3.4.1 SORF2 融合目的蛋白的表达纯化及分析鉴定
3.4.2 间接免疫荧光(IFA)鉴定高效价多克隆抗体特异性
3.4.3 GX0101Δsorf2 的 PCR 鉴定结果
3.4.4 间接免疫荧光鉴定 GX0101Δsorf2 的结果
3.4.5 Western blot 对重组病毒 GX0101 sorf2 以及 SORF2 蛋白的特异性鉴定
3.4.6 GX0101Δsorf2 在 CEF 细胞上的复制能力
3.4.7 GX0101Δsorf2 与亲本病毒 bac-GX0101 在鸡体内的病毒血症比较
3.4.8 GX0101Δsorf2 对 SPF 鸡的致病性
3.4.9 GX0101Δsorf2 对鸡体体液免疫应答的影响
3.4.10 GX0101Δsorf2 对鸡体重的影响
3.4.11 GX0101Δsorf2 和 GX0101 横向传播能力的比较
3.5 插入 ALV-LTR 的重组 MDV 的构建及其生物学活性的比较
3.5.1 不同重组 BAC 克隆质粒的 PCR 鉴定
3.5.2 拯救的重组病毒 GX0101-ALV-LTR 在细胞培养上形成的病毒蚀斑
3.5.3 插入 ALV-LTR 片段对重组 MDV SORF2 基因的转录和表达影响
3.5.4 GX0101-ALV-LTR 在细胞上复制性能
3.5.5 GX0101-ALV-LTR 基因组中 ALV-LTR 片段稳定性的鉴定
3.5.6 GX0101-ALV-LTR 对 SPF 鸡体重的影响
3.5.7 GX0101-ALV-LTR 对 SPF 鸡抗体水平的影响
3.5.8 GX0101-ALV-LTR 对 SPF 鸡的致死率和致肿瘤率
3.6 LTR 插入片段对重组病毒的病毒基因表达以及重组病毒对宿主基因表达的影响
3.6.1 样品总 RNA 的提取和质检结果
3.6.2 Agilent 表达谱芯片结果的质控检测结果
3.6.3 Agilent 表达谱芯片扫描数据归一化结果
3.6.4 重组病毒GX0101、GX0101-ALV-LTR 与GX0101 LTR 的病毒基因差异表达的分析结果
3.6.5 感染 GX0101、GX0101-ALV-LTR、GX0101 LTR 鸡的显著差异表达基因的分析结果
3.6.6 Northern blot 技术对重组病毒 SORF2、US1、US10 基因的鉴定结果
3.6.7 荧光定量 PCR 检测重组病毒 SORF2、US1、US10 基因表达结果
4 讨论
5 结论
6 参考文献
7 附录
8 致谢
9 攻读学位期间发表论文情况
本文编号：3760737
【文章页数】：167 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
符号说明及缩略词
中文摘要
Abstract
1 前言
1.1 马立克氏病病毒（MDV）的研究进展
1.1.1 病原学
1.1.2 流行病学
1.1.3 病理生物学
1.1.4 诊断技术
1.2 MDV 分子生物学研究进展
1.2.1 MDV 基因组结构
1.2.2 MDV 结构蛋白及相关基因
1.3 禽反转录病毒与 MDV 基因重组的研究进展
1.3.1 MDV 与 REV 间的基因重组
1.3.2 MDV 与 ALV 间的基因重组
1.3.3 REV 与 MDV 基因重组的机制
1.3.4 带有 REV-LTR 的重组 MDV 野毒株 GX0101 流行病学意义
1.4 BAC 技术和同源重组技术在 MDV 研究中的应用
1.4.1 细菌人工染色体载体系统(BAC)
1.4.2 利用 BAC 构建 MDV 感染性克隆
1.4.3 基于 MDV BAC 感染性克隆的同源重组技术
1.5 基因芯片技术在 MDV 研究中的应用
1.5.1 基因芯片的简介
1.5.2 基因芯片的应用
1.6 MD 疫苗研究进展
1.6.1 常规致弱疫苗
1.6.2 新型基因工程疫苗
1.7 本研究的目的及意义
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 常规分子克隆试剂
2.1.2 细胞培养相关试剂
2.1.3 荧光定量相关试剂
2.1.4 多克隆抗体制备相关试剂
2.1.5 Agilent 表达谱芯片相关试剂
2.1.6 主要仪器
2.1.7 相关疫苗及抗原
2.1.8 相关病毒及菌种
2.1.9 病毒增殖与鉴定相关试验材料
2.2 常规试验操作方法
2.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备
2.2.2 MDV 的拯救、鉴定
2.2.3 MDV 的增殖、定量
2.2.4 MDVBAC 质粒的大量制备及电转化
2.2.5 重组蛋白的纯化以及SDS-PAGE 蛋白质电泳
2.2.6 淋巴细胞的分离以及DNA 的提取
2.2.7 病毒RNA 的提取以及反转录
2.3 自然重组马立克氏病毒 GX0101 的全基因组序列的测定和比较分析
2.3.1 GX0101 感染性克隆GX0101-BAC 质粒的制备
2.3.2 GX0101 感染性克隆GX0101-BAC 的测序
2.3.3 GX0101 的全基因组分析
2.4 以 GX0101 构建 meq 基因缺失疫苗候选株及其安全性免疫保护效果的比较研究
2.4.1 利用同源重组技术构建 SC9-1(GX0101Δmeq kana)株 MDV
2.4.2 利用同源重组技术构建SC9-2(GX0101 meq kana BAC)株MDV
2.4.3 SC9-1、SC9-2 株MDV 的拯救、鉴定
2.4.4 SC9-1、SC9-2 株MDV 在细胞上的复制水平
2.4.5 SC9-1、SC9-2 株MDV 对SPF 鸡的安全性
2.4.6 SC9-1 株MDV 在鸡体内的增殖水平
2.4.7 SC9-1、SC9-2 株MDV 对SPF 鸡的免疫保护效果
2.4.8 SC9-1 株MDV 对海兰褐蛋鸡的免疫保护效果
2.4.9 SC9-1 株MDV 对SPF 鸡感染低剂量rMd5 的免疫保护效果
2.5 GX0101 在自然感染传播过程中竞争性选择压优势的模拟分析
2.5.1 用于区分MDVGX0101 和GX0101 LTR 的荧光定量PCR 探针设计
2.5.2 双重荧光定量PCR 探针标准曲线的制备
2.5.3 接种相同剂量GX0101 和GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较
2.5.4 接种不同剂量GX0101 和GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较
2.6 缺失 GX0101 SORF2 基因的重组病毒的构建及其生物学活性比较
2.6.1 鼠抗MDVSORF2 蛋白多克隆抗体制备
2.6.2 敲除SORF2 基因的重组病毒GX0101Δsorf2 的构建
2.6.3 间接免疫荧光试验鉴定重组病毒GX0101Δsorf238
2.6.4 Western blot 对重组病毒GX0101Δsorf2 以及SORF2 蛋白特异性鉴定
2.6.5 GX0101Δsorf2 在CEF 细胞上的复制能力的检测
2.6.6 GX0101Δsorf2 的致病性试验
2.6.7 GX0101Δsorf2 在鸡体内的的病毒血症的检测
2.6.8 GX0101Δsorf2 对SPF 鸡体液免疫应答的影响
2.6.9 GX0101Δsorf2 和GX0101 横向传播能力比较
2.7 插入 ALV-LTR 的重组 MDV 的构建及其生物学活性的比较研究
2.7.1 插入ALV-LTR 片段的重组MDV 的构建
2.7.2 重组MDVGX0101-ALV-LTR 的拯救
2.7.3 GX0101-ALV-LTR 在细胞上的复制能力
2.7.4 间接免疫荧光鉴定GX0101-ALV-LTR SORF2 蛋白的表达
2.7.5 GX0101-ALV-LTR 在CEF 细胞培养的稳定性鉴定
2.7.6 GX0101-ALV-LTR 的致病性检测及鸡体内的稳定性鉴定
2.8 LTR 插入片段对重组病毒的病毒基因表达以及重组病毒对宿主基因表达的影响
2.8.1 不同CEF 细胞感染不同重组病毒的总RNA 提取
2.8.2 样品的RNA 的放大和荧光标记
2.8.3 Agilent 表达谱芯片杂交
2.8.4 Agilent 表达谱芯片扫描
2.8.5 Agilent 表达谱芯片结果的质控检测
2.8.6 重组病毒GX0101、GX0101-ALV-LTR 与GX0101 LTR 的病毒基因差异表达的分析
2.8.7 重组病毒GX0101、GX0101-ALV-LTR 与GX0101 LTR 对宿主基因表达的差异性分析
2.8.8 GX0101 重组REV-LTR 片段对其重组位点后的基因转录水平的影响
3 结果与分析
3.1 GX0101 的全基因组序列的测定和比较分析
3.1.1 GX0101 的基因组结构以及与其它不同株 MDV 的系统进化关系
3.1.2 从 GX0101 全基因组水平比较分析 REV-LTR 插入片段
3.1.3 相对其它毒株 GX0101 基因组中缺失的片段
3.1.4 相对其它毒株 GX0101 基因组中增加的片段
3.1.5 GX0101 基因组的开放阅读框和单核苷酸多态性
3.1.6 GX0101 与英国分离株 C12/130 感染性克隆的基因组差异比较
3.2 以 GX0101 构建 meq 基因缺失疫苗候选株及其安全性免疫保护效果的比较
3.2.1 SC9-1、SC9-2 疫苗候选株的构建和鉴定
3.2.2 SC9-1、SC9-2 株 MDV 拯救鉴定结果
3.2.3 SC9-1、SC9-2 株 MDV 在细胞上的复制能力
3.2.4 SC9-1 株 MDV 在鸡体内的增殖水平
3.2.5 SC9-1、SC9-2 株 MDV 对 SPF 鸡的安全性
3.2.6 SC9-1、SC9-2 株 MDV 对 SPF 鸡的免疫保护效果
3.2.7 SC9-1 株 MDV 对海兰褐蛋鸡的免疫保护效果
3.2.8 SC9-1 株 MDV 对 SPF 鸡感染低剂量 rMd5 的免疫保护效果
3.2.9 SC9-1 疫苗候选株中试产品与 CVI988/Rispens 疫苗的保护性免疫力
3.3 GX0101 在自然感染传播过程中竞争性选择压优势的模拟分析
3.3.1 区分 MDV GX0101 和 GX0101 LTR 的荧光定量 PCR 探针具有良好的特异性
3.3.2 双重荧光定量 PCR 探针标准曲线的制备
3.3.3 接种相同剂量 GX0101 和 GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较
3.3.4 接种不同剂量 GX0101 和 GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较
3.4 缺失 GX0101 SORF2 基因的重组病毒的构建及其生物学活性的研究
3.4.1 SORF2 融合目的蛋白的表达纯化及分析鉴定
3.4.2 间接免疫荧光(IFA)鉴定高效价多克隆抗体特异性
3.4.3 GX0101Δsorf2 的 PCR 鉴定结果
3.4.4 间接免疫荧光鉴定 GX0101Δsorf2 的结果
3.4.5 Western blot 对重组病毒 GX0101 sorf2 以及 SORF2 蛋白的特异性鉴定
3.4.6 GX0101Δsorf2 在 CEF 细胞上的复制能力
3.4.7 GX0101Δsorf2 与亲本病毒 bac-GX0101 在鸡体内的病毒血症比较
3.4.8 GX0101Δsorf2 对 SPF 鸡的致病性
3.4.9 GX0101Δsorf2 对鸡体体液免疫应答的影响
3.4.10 GX0101Δsorf2 对鸡体重的影响
3.4.11 GX0101Δsorf2 和 GX0101 横向传播能力的比较
3.5 插入 ALV-LTR 的重组 MDV 的构建及其生物学活性的比较
3.5.1 不同重组 BAC 克隆质粒的 PCR 鉴定
3.5.2 拯救的重组病毒 GX0101-ALV-LTR 在细胞培养上形成的病毒蚀斑
3.5.3 插入 ALV-LTR 片段对重组 MDV SORF2 基因的转录和表达影响
3.5.4 GX0101-ALV-LTR 在细胞上复制性能
3.5.5 GX0101-ALV-LTR 基因组中 ALV-LTR 片段稳定性的鉴定
3.5.6 GX0101-ALV-LTR 对 SPF 鸡体重的影响
3.5.7 GX0101-ALV-LTR 对 SPF 鸡抗体水平的影响
3.5.8 GX0101-ALV-LTR 对 SPF 鸡的致死率和致肿瘤率
3.6 LTR 插入片段对重组病毒的病毒基因表达以及重组病毒对宿主基因表达的影响
3.6.1 样品总 RNA 的提取和质检结果
3.6.2 Agilent 表达谱芯片结果的质控检测结果
3.6.3 Agilent 表达谱芯片扫描数据归一化结果
3.6.4 重组病毒GX0101、GX0101-ALV-LTR 与GX0101 LTR 的病毒基因差异表达的分析结果
3.6.5 感染 GX0101、GX0101-ALV-LTR、GX0101 LTR 鸡的显著差异表达基因的分析结果
3.6.6 Northern blot 技术对重组病毒 SORF2、US1、US10 基因的鉴定结果
3.6.7 荧光定量 PCR 检测重组病毒 SORF2、US1、US10 基因表达结果
4 讨论
5 结论
6 参考文献
7 附录
8 致谢
9 攻读学位期间发表论文情况
本文编号：3760737
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3760737.html
