水貂圆环病毒实时定量PCR和间接ELISA检测方法的建立及应用
发布时间：2023-03-12 20:12
水貂圆环病毒(Mink Circovirus,MiCV)是2014年发现的一种与水貂腹泻有关的新型圆环病毒。目前,对于MiCV的病原学、流行情况和致病机理的研究较少,病毒的传播方式等研究未见报导,MiCV对于水貂养殖业的经济影响仍未知。因此,对于MiCV的高效、准确、特异性的检测方法的建立显得尤为重要。目前已报道的检测方法只有常规PCR及RPA方法,对于水貂圆环病毒抗体的检测及病毒定量检测未见报道。本研究首先根据MiCV的Cap基因设计特异性引物,构建含目的片段的标准质粒建立实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR)的方法,绘制了标准曲线方程Y=-3.155X+39.202,得到各个参数分别为:扩增效率为107.447%,斜率为-3.155,相关系数(R2)为0.974。最低可检测到101 copies/μL,重复性较好。应用RT-qPCR方法定量检测来自不同省份水貂组织、粪便、血清样品,阳性率分别为:山东52.88%、河北67.90%、辽宁58.46%、吉林38.46%、黑龙江30.30%,总阳性...
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 前言
1.1 圆环病毒的概述
1.2 圆环病毒的致病机制
1.3 水貂圆环病毒
1.3.1 水貂圆环病毒的发现
1.3.2 水貂圆环病毒基因组结构
1.3.3 水貂圆环病流行情况
1.3.4 水貂圆环病诊断技术
1.3.5 研究展望
1.4 实时定量PCR技术优点及应用
1.5 间接ELISA技术优点及应用
1.6 研究的目的和意义
2 材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 载体
2.1.2 主要酶类及试剂
2.1.3 主要溶剂的配制
2.1.4 试验仪器和设备
2.1.5 病毒、血清、病料
2.2 实时定量PCR检测方法的建立及应用
2.2.1 基因扩增
2.2.2 重组质粒的构建
2.2.3 重组质粒DNA标准品的制备
2.2.4 实时定量PCR反应条件优化
2.2.5 标准曲线建立
2.2.6 特异性试验
2.2.7 重复性试验
2.2.8 临床样品的检测与验证
2.3 人工感染试验
2.3.1 病毒的制备
2.3.2 实验动物
2.3.3 MiCV人工感染水貂及样品采集
2.3.4 样品处理
2.3.5 检测MiCV感染水貂后病毒分布情况
2.4 水貂圆环病毒全基因组序列分析
2.4.1 病毒DNA模板的制备
2.4.2 MiCV全基因组引物的设计与合成
2.4.3 MiCV全基因组的PCR扩增
2.4.4 扩增产物的回收
2.4.5 目的片段与pMD-T载体的连接和转化
2.4.6 基因组分析
2.5 间接ELISA检测方法的建立及应用
2.5.1 引物的设计与合成
2.5.2 重组蛋白的包涵体表达分析及纯化
2.5.3 间接ELISA条件优化
2.5.4 判定标准的测定
2.5.5 特异性试验
2.5.6 批内及批间重复性试验
2.5.7 间接ELISA方法与Western Blot方法比较
2.5.8 临床样品的检测与验证
3 结果
3.1 实时定量PCR检测方法的建立及应用
3.1.1 Cap基因PCR扩增结果
3.1.2 pMDT-cap重组质粒的鉴定
3.1.3 标准品
3.1.4 实时定量PCR最佳反应条件
3.1.5 标准曲线建立
3.1.6 特异性试验
3.1.7 重复性试验
3.1.8 临床样品的检测结果
3.2 人工感染试验
3.2.1 MiCV人工感染水貂疾病模型临床症状
3.2.2 检测MiCV感染水貂后病毒分布情况
3.2.3 MiCV在感染水貂中不同组织感染率
3.3 水貂圆环病毒全基因组序列分析
3.3.1 MiCV全基因组扩增结果
3.3.2 重组质粒的鉴定
3.3.3 序列测定结果
3.3.4 MiCV同源性、遗传变异及进化分析
3.4 间接ELISA检测方法的建立及应用
3.4.1 重组质粒的鉴定和表达
3.4.2 重组蛋白的包涵体表达分析及纯化
3.4.3 重组蛋白纯化后Western Blot鉴定
3.4.4 间接ELISA最佳反应条件
3.4.5 判定标准的确定
3.4.6 批内及批间重复性试验
3.4.7 特异性试验
3.4.8 间接ELISA方法与WesternBlot方法比较
3.4.9 临床样品的检测结果
4 讨论
4.1 实时定量PCR检测方法的建立及检测
4.2 间接ELISA检测方法的建立及检测
4.3 建立的实时定量PCR方法与间接ELISA方法比较
4.4 水貂圆环病毒全基因组序列分析
4.5 MiCV在感染水貂组织中分布情况
4.6 MiCV在不同省份流行分布情况
4.7 根据目前研究对于MiCV的评估
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
本文编号：3761873
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 前言
1.1 圆环病毒的概述
1.2 圆环病毒的致病机制
1.3 水貂圆环病毒
1.3.1 水貂圆环病毒的发现
1.3.2 水貂圆环病毒基因组结构
1.3.3 水貂圆环病流行情况
1.3.4 水貂圆环病诊断技术
1.3.5 研究展望
1.4 实时定量PCR技术优点及应用
1.5 间接ELISA技术优点及应用
1.6 研究的目的和意义
2 材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 载体
2.1.2 主要酶类及试剂
2.1.3 主要溶剂的配制
2.1.4 试验仪器和设备
2.1.5 病毒、血清、病料
2.2 实时定量PCR检测方法的建立及应用
2.2.1 基因扩增
2.2.2 重组质粒的构建
2.2.3 重组质粒DNA标准品的制备
2.2.4 实时定量PCR反应条件优化
2.2.5 标准曲线建立
2.2.6 特异性试验
2.2.7 重复性试验
2.2.8 临床样品的检测与验证
2.3 人工感染试验
2.3.1 病毒的制备
2.3.2 实验动物
2.3.3 MiCV人工感染水貂及样品采集
2.3.4 样品处理
2.3.5 检测MiCV感染水貂后病毒分布情况
2.4 水貂圆环病毒全基因组序列分析
2.4.1 病毒DNA模板的制备
2.4.2 MiCV全基因组引物的设计与合成
2.4.3 MiCV全基因组的PCR扩增
2.4.4 扩增产物的回收
2.4.5 目的片段与pMD-T载体的连接和转化
2.4.6 基因组分析
2.5 间接ELISA检测方法的建立及应用
2.5.1 引物的设计与合成
2.5.2 重组蛋白的包涵体表达分析及纯化
2.5.3 间接ELISA条件优化
2.5.4 判定标准的测定
2.5.5 特异性试验
2.5.6 批内及批间重复性试验
2.5.7 间接ELISA方法与Western Blot方法比较
2.5.8 临床样品的检测与验证
3 结果
3.1 实时定量PCR检测方法的建立及应用
3.1.1 Cap基因PCR扩增结果
3.1.2 pMDT-cap重组质粒的鉴定
3.1.3 标准品
3.1.4 实时定量PCR最佳反应条件
3.1.5 标准曲线建立
3.1.6 特异性试验
3.1.7 重复性试验
3.1.8 临床样品的检测结果
3.2 人工感染试验
3.2.1 MiCV人工感染水貂疾病模型临床症状
3.2.2 检测MiCV感染水貂后病毒分布情况
3.2.3 MiCV在感染水貂中不同组织感染率
3.3 水貂圆环病毒全基因组序列分析
3.3.1 MiCV全基因组扩增结果
3.3.2 重组质粒的鉴定
3.3.3 序列测定结果
3.3.4 MiCV同源性、遗传变异及进化分析
3.4 间接ELISA检测方法的建立及应用
3.4.1 重组质粒的鉴定和表达
3.4.2 重组蛋白的包涵体表达分析及纯化
3.4.3 重组蛋白纯化后Western Blot鉴定
3.4.4 间接ELISA最佳反应条件
3.4.5 判定标准的确定
3.4.6 批内及批间重复性试验
3.4.7 特异性试验
3.4.8 间接ELISA方法与WesternBlot方法比较
3.4.9 临床样品的检测结果
4 讨论
4.1 实时定量PCR检测方法的建立及检测
4.2 间接ELISA检测方法的建立及检测
4.3 建立的实时定量PCR方法与间接ELISA方法比较
4.4 水貂圆环病毒全基因组序列分析
4.5 MiCV在感染水貂组织中分布情况
4.6 MiCV在不同省份流行分布情况
4.7 根据目前研究对于MiCV的评估
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
本文编号：3761873
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3761873.html
