犏牛精子发生阻滞相关microRNA鉴定与功能分析
发布时间：2023-03-18 14:35
犏牛是雄性普通牛和雌性牦牛的种间F1代杂种,生产性能显著优于亲本,对青藏高原恶劣气候环境也具有杰出的适应能力,但雄性犏牛因精子发生阻滞不育极大的限制了其在牦牛杂交育种中的有效利用。miRNA作为一类非编码小RNA在转录后水平通过影响靶mRNA的稳定性或者抑制蛋白翻译过程从而调控基因的表达水平。为了解miRNA在犏牛精子发生阻滞中可能的调控作用,本研究通过illumina深度测序筛选鉴定牦牛及犏牛睾丸组织间差异表达miRNA;并初步分析了bta-miR-34c调控牦牛精原细胞分化的分子机制。结果如下:(1)通过牦牛与犏牛睾丸组织TUNEL-POD染色分析发现,犏牛睾丸组织生精小管内只有单层附着在生精小管基底膜的精原细胞以及少量精母细胞,无圆形或延伸的精子细胞,并且精原细胞最早开始发生凋亡,至精母细胞时期加重,从而导致后续精子发生中断以致无精子生成;(2)通过牦牛与犏牛睾丸组织转录组miRNA高通量测序以及生物信息学分析发现,61个miRNA在犏牛与牦牛睾丸组织之间差异表达显著,其中miR-19b-3p、miR-592、miR-135a、miR-378和miR-184参与SSCs自我更新以...
【文章页数】：88 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
缩略词表
第一章 文献综述
1.1 犏牛雄性不育的研究现状
1.2 miRNA的研究概述
1.2.1 miRNA的发现
1.2.2 miRNA的来源
1.3 miRNA在精子发生过程中的调控作用
1.3.1 miRNA对原始生殖细胞的影响
1.3.2 miRNA对精原细胞自我更新以及分化的影响
1.3.3 miRNA对精母细胞减数分裂以及精子形成的影响
1.3.4 miRNA相关蛋白对于精子发生的影响
1.4 精原干细胞分离鉴定研究现状
1.4.1 精原干细胞的分离富集
1.4.2 两步酶消化法
1.4.3 单位重力沉降
1.4.4 不连续Percoll密度梯度离心
1.4.5 免疫磁珠细胞分选
1.4.6 流式细胞分选技术
1.5 本研究的目的与意义
第二章 牦牛和犏牛睾丸组织中差异表达miRNA分析
2.1 材料和方法
2.1.1 实验动物
2.1.2 主要的仪器设备
2.1.3 主要的试剂
2.1.4 牦牛及犏牛睾丸组织石蜡切片
2.1.5 牦牛及犏牛睾丸组织TUNEL-POD检测
2.1.6 RNA提取
2.1.7 miRNA克隆测序以及数据分析
2.1.8 差异表达miRNA分析
2.1.9 差异表达miRNA靶基因预测以及GO条目KEGG通路富集分析
2.1.10 差异表达miRNA及其靶基因RT-qPCR验证
2.2 结果与分析
2.2.1 牦牛及犏牛睾丸组织细胞凋亡分析
2.2.2 小RNA分类
2.2.3 差异表达miRNA鉴定
2.2.4 靶基因预测以及通路富集分析
2.2.5 差异表达miRNA及其靶基因RT-qPCR验证
2.3 讨论
2.3.1 差异表达miRNA在精原细胞自我更新与分化过程中的调控作用
2.3.2 差异表达miRNA在精母细胞减数分裂过程中的调控作用
2.4 小结
第三章 bta-miR-34c对牦牛精原细胞分化的影响
3.1 材料与方法
3.1.1 实验动物
3.1.2 主要的仪器设备
3.1.3 主要的试剂
3.1.4 牦牛生精细胞单细胞悬液制备
3.1.5 牦牛生精细胞STA-PUT自然沉降分离
3.1.6 牦牛生精细胞总RNA提取以及RT-PCR表型鉴定
3.1.7 牦牛精原细胞bta-miR-34c转染
3.1.8 牦牛精原细胞转染bta-miR-34c后相关基因RT-qPCR检测
3.2 结果
3.2.1 牦牛生精细胞的分离鉴定
3.2.2 牦牛精原细胞bta-miR-34c过表达分析
3.3 讨论
3.4 小结
结论
致谢
参考文献
附录
攻读学位期间取得的研究成果
本文编号：3763315
【文章页数】：88 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
缩略词表
第一章 文献综述
1.1 犏牛雄性不育的研究现状
1.2 miRNA的研究概述
1.2.1 miRNA的发现
1.2.2 miRNA的来源
1.3 miRNA在精子发生过程中的调控作用
1.3.1 miRNA对原始生殖细胞的影响
1.3.2 miRNA对精原细胞自我更新以及分化的影响
1.3.3 miRNA对精母细胞减数分裂以及精子形成的影响
1.3.4 miRNA相关蛋白对于精子发生的影响
1.4 精原干细胞分离鉴定研究现状
1.4.1 精原干细胞的分离富集
1.4.2 两步酶消化法
1.4.3 单位重力沉降
1.4.4 不连续Percoll密度梯度离心
1.4.5 免疫磁珠细胞分选
1.4.6 流式细胞分选技术
1.5 本研究的目的与意义
第二章 牦牛和犏牛睾丸组织中差异表达miRNA分析
2.1 材料和方法
2.1.1 实验动物
2.1.2 主要的仪器设备
2.1.3 主要的试剂
2.1.4 牦牛及犏牛睾丸组织石蜡切片
2.1.5 牦牛及犏牛睾丸组织TUNEL-POD检测
2.1.6 RNA提取
2.1.7 miRNA克隆测序以及数据分析
2.1.8 差异表达miRNA分析
2.1.9 差异表达miRNA靶基因预测以及GO条目KEGG通路富集分析
2.1.10 差异表达miRNA及其靶基因RT-qPCR验证
2.2 结果与分析
2.2.1 牦牛及犏牛睾丸组织细胞凋亡分析
2.2.2 小RNA分类
2.2.3 差异表达miRNA鉴定
2.2.4 靶基因预测以及通路富集分析
2.2.5 差异表达miRNA及其靶基因RT-qPCR验证
2.3 讨论
2.3.1 差异表达miRNA在精原细胞自我更新与分化过程中的调控作用
2.3.2 差异表达miRNA在精母细胞减数分裂过程中的调控作用
2.4 小结
第三章 bta-miR-34c对牦牛精原细胞分化的影响
3.1 材料与方法
3.1.1 实验动物
3.1.2 主要的仪器设备
3.1.3 主要的试剂
3.1.4 牦牛生精细胞单细胞悬液制备
3.1.5 牦牛生精细胞STA-PUT自然沉降分离
3.1.6 牦牛生精细胞总RNA提取以及RT-PCR表型鉴定
3.1.7 牦牛精原细胞bta-miR-34c转染
3.1.8 牦牛精原细胞转染bta-miR-34c后相关基因RT-qPCR检测
3.2 结果
3.2.1 牦牛生精细胞的分离鉴定
3.2.2 牦牛精原细胞bta-miR-34c过表达分析
3.3 讨论
3.4 小结
结论
致谢
参考文献
附录
攻读学位期间取得的研究成果
本文编号：3763315
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