抗亚洲I型口蹄疫病毒单链抗体的表达与纯化

发布时间：2023-03-21 18:27

　　单链抗体（single-chain variable Fragment，scFv）主要是从杂交瘤细胞、免疫小鼠的脾细胞和人的B淋巴细胞获得。scFv是由重链可变区和轻链可变区构成的非共价二聚体，可以用来构建重组scFv抗体。首先，从杂交瘤细胞（或脾细胞、淋巴细胞、骨髓）分离mRNA，经反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行抗体基因PCR。通过这种方法，建立了含有不同种类VH和VL基因的抗体库。单链抗体结构包括重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），VH和VL通过一段柔性肽连接，使得scFv能在E.coli中表达成具有功能性的蛋白，这种结构增加了scFv的高亲和力和特异性。 实验将构建的口蹄疫病毒scFv基因与T7Select10-3b载体连接，经体外包装，BLT5403菌株增殖，文库扩增，进行体外亲和筛选，建立了T7噬菌体cDNA展示文库。扩增核糖体展示筛选的scFv基因，将目的片段与真核表达载体pEGFP-N1连接，构建融合真核表达载体pEGFP-N1-scFv。将pEGFP-N1-scFv质粒和空载体质粒通过脂质体介导的方法转染进CHO细胞中，在荧光显微镜下观察目的蛋白表达情况。...

【文章页数】：59 页

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 重组抗体技术
    1.2 单链抗体SCFV
    1.3 SCFV 抗体的分型
    1.4 SCFV 的表达
    1.5 噬菌体展示技术
    1.6 噬菌体展示SCFV的优势
    1.7 应用
        1.7.1 医疗应用
        1.7.2 诊断应用
        1.7.3 scFv 在口蹄疫方面的应用
第二章 口蹄疫病毒单链抗体 CDNAT7 噬菌体展示文库的构建
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验试剂
        2.1.2 实验仪器
        2.1.3 脾细胞、载体及菌株
        2.1.4 主要溶液及配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 抗口蹄疫单链抗体的构建
        2.2.2 连接 scFv 和 T7 噬菌体载体
        2.2.3 菌体体外包装
        2.2.4 文库滴度的测定
        2.2.5 噬菌斑鉴定
        2.2.6 文库的扩增
        2.2.7 文库筛选
        2.2.8 插入片段的序列测定
    2.3 实验结果
        2.3.1 scFv 的构建
        2.3.2 T7 噬菌体展示文库的鉴定
    2.4 讨论
第三章 口蹄疫病毒单链抗体在 CHO 细胞中的瞬时表达
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验试剂
        3.1.2 基因、载体和表达细胞
        3.1.3 实验仪器
        3.1.4 主要溶液及其配置方法
    3.2 实验方法
        3.2.1 引物设计
        3.2.2 目的基因克隆
        3.2.3 PCR 产物纯化与回收
        3.2.4 回收产物及真核表达载体的酶切、连接与转化
        3.2.5 目的基因与真核表达载体的连接
        3.2.6 连接产物的转化
        3.2.7 重组表达质粒的鉴定
        3.2.8 重组表达质粒的大抽提
        3.2.9 CHO 细胞的复苏、培养与冻存
        3.2.10 CHO 细胞的转染
        3.2.11 目的蛋白的亚细胞定位
    3.3 结果
        3.3.1 目的基因的克隆
        3.3.2 重组真核表达质粒的鉴定
        3.3.3 质粒 scFv- pEGFP-N1 小量制备的浓度及 OD 值
        3.3.4 CHO 细胞的培养
        3.3.5 目的蛋白在 CHO 细胞中的表达
        3.3.6 目的蛋白的亚细胞定位
    3.4 讨论
第四章 口蹄疫病毒单链抗体的可溶性表达及鉴定
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验试剂
        4.1.2 实验仪器
        4.1.3 载体及宿主细胞
        4.1.4 主要溶液及配方
    4.2 实验方法
        4.2.1 scFv 基因的克隆
        4.2.2 scFv 基因片段和载体 pSMK 的酶切
        4.2.3 scFv 基因片段和载体 pSMK 的连接
        4.2.4 连接产物的转化
        4.2.5 重组表达质粒的鉴定
        4.2.6 融合表达载体转入表达菌中
        4.2.7 16℃大量诱导表达及纯化
        4.2.8 口蹄疫病毒 scFv 与 FMDV 亲和力和特异性的 ELISA 鉴定
    4.3 结果
        4.3.1 融合表达载体的构建
        4.3.2 抗口蹄疫病毒 scFv 的表达及纯化
        4.3.3 ELISA 鉴定
    4.4 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历



本文编号：3767071