表达禽β—防御素的重组乳酸菌作为免疫佐剂的研究
发布时间：2023-03-25 07:10
益生乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)菌体较大,不存在内毒素,可以吸附黏膜细胞上并定居于黏膜表层。因此,乳酸菌是表达和传递治疗性和预防性外源蛋白的首选载体。禽β-防御素(AvBDs)是主要存在于天然黏膜系统的天然抗菌肽之一,主要发挥抗感染、广谱抗菌和广泛的免疫调节作用,特别是禽β-防御素是一种小的阳离子非糖基化的多肽,非常适合于原核表达。因此,本研究采用食品级乳酸乳球菌NZ3900宿主菌株,构建了完全食品级表达禽β-防御素的重组乳酸菌。本研究利用3种表达质粒和食品级宿主菌株构建了3套表达禽β-防御素的重组乳酸菌。采用的3种表达系统和食品级乳酸乳球菌NZ3900菌株作为宿主菌株,分别构建了表达禽β-防御素1(AvBD1)、禽β-防御素2(AvBD2)、禽β-防御素6(AvBD6)、禽β-防御素13(AvBD13)和融合禽β-防御素1/2/6/13功能片段组成的融合禽β-防御素AvBD12613,共11株重组乳酸菌,其中5株重组乳酸菌的表达量稳定,蛋白大小正确,是本研究用于体外筛选和体内动物试验验证的重组乳酸菌。利用表达β-防御素的重组乳酸菌的菌体裂解混合物体与巨噬...
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
主要符号对照表
第一章 绪论
1.1 乳酸菌概述
1.2 乳酸菌活载体表达系统
1.2.1 宿主菌的选择
1.2.2 乳酸菌表达方式的选择
1.2.3 乳酸菌表达系统的优势及展望
1.3 免疫佐剂及免疫增强剂
1.3.1 免疫增强剂的定义及分类
1.3.2 免疫增强剂的作用机制
1.3.3 免疫佐剂的定义及分类
1.3.4 免疫佐剂的作用机制
1.3.5 免疫佐剂及免疫增强剂的研究现状及展望
1.4 禽β-防御素概述
1.4.1 禽β-防御素的定义及分类
1.4.2 禽β-防御素的免疫学功能
1.4.3 禽β-防御素作为免疫佐剂或免疫增强剂的研究进展及展望
1.4.4 新城疫灭活疫苗及其免疫佐剂
1.4.5 新城疫活疫苗及其免疫佐剂
1.5 目的与意义
第二章 表达禽β-防御素的重组乳酸菌的构建
2.1 材料
2.1.1 质粒和菌株
2.1.2 主要试剂和仪器
2.2 方法
2.2.1 引物设计及合成
2.2.2 目的片段的线性扩增
2.2.3 目的片段的胶回收
2.2.4 宿主菌株NZ3900感受态的制备
2.2.5 重组质粒pNZ8149-Av BDs构建
2.2.6 重组质粒pNZ8149-Nis RK-Cm-Av BDs的构建
2.2.7 重组质粒pNZ2103-Av BDs构建
2.2.8 重组乳酸菌的构建
2.2.9 重组乳酸菌的鉴定
2.2.10 重组乳酸菌的诱导表达
2.3 结果
2.3.1 目的基因片段的扩增
2.3.2 重组乳酸菌r-L.Lactis-pNZ8149-AvBDs的筛选及PCR鉴定
2.3.3 重组乳酸菌r-L.Lactis-pNZ8149-NisRK-Cm-Av BDs的筛选及PCR鉴定
2.3.4 重组乳酸菌r-L.Lactis-pNZ2103-AvBDs的筛选及PCR鉴定
2.3.5 重组乳酸菌r-L.Lactis-pNZ8149-AvBDs目的蛋白的表达鉴定
2.3.6 重组乳酸菌r-L.Lactis-pNZ8149-NisRK-Cm-Av BDs目的蛋白的表达鉴定
2.3.7 重组乳酸菌r-L.Lactis-pNZ2103-AvBDs目的蛋白的表达鉴定
2.4 表达禽β-防御素重组乳酸菌菌体裂解混合物的制备
2.5 讨论
第三章 重组禽β-防御素体外免疫调节活性的检测
3.1 材料
3.1.1 细胞
3.1.2 主要试剂及仪器
3.2 方法
3.2.1 重组禽β-防御素激活J774-DualTM报告细胞系免疫信号通路的检测
3.2.2 重组β-防御素刺激PBMCs产生细胞因子的检测
3.2.3 重组β-防御素刺激鸡巨噬细胞(HD11)产生细胞因子的检测
3.3 结果
3.3.1 重组禽β-防御素激活J774-DualTM报告细胞系免疫信号通路的检测
3.3.2 重组β-防御素刺激PBMCs产生细胞因子的检测
3.3.3 重组β-防御素激活PBMCs CD80及CD86 分子的检测
3.3.4 重组β-防御素激活HD11IL-10的检测
3.3.5 重组β-防御素激活HD11 CD80和CD86 分子的检测
3.4 讨论
第四章 重组β-防御素作为新城疫活疫苗免疫佐剂的初步研究
4.1 材料
4.1.1 毒株、动物及疫苗
4.1.2 主要试剂与仪器
4.2 方法
4.2.1 新城疫活疫苗、重组β-防御素免疫佐剂制备及注射剂量
4.2.2 动物实验设计方案
4.2.3 血凝试验和血凝抑制试验检测血清抗体滴度
4.2.4 ELISA检测血清细胞因子的含量
4.2.5 PBMCs和外周血白细胞的活性检测
4.3 结果
4.3.1 ELISA检测血清中细胞因子
4.3.2 PBMCs和外周血白细胞增殖活性
4.3.3 LPS激活PBMCs和外周血白细胞增殖活性检测
4.3.4 NDV攻毒PBMCs和外周血白细胞后增殖活性检测
4.3.5 HA和HI试验检测血清抗体滴度
4.4 讨论
第五章 重组β-防御素作为新城疫油乳剂灭活疫苗免疫佐剂的研究
5.1 材料
5.1.1 毒株、动物及疫苗
5.1.2 主要试剂与仪器
5.2 方法
5.2.1 重组β-防御素免疫佐剂新城疫灭活疫苗的制备及注射剂量
5.2.2 动物实验设计方案
5.2.3 血凝试验和血凝抑制试验检测血清抗体滴度
5.2.4 ELISA检测血清细胞因子的含量
5.2.5 PBMCs和外周血白细胞的增殖活性检测
5.3 结果
5.3.1 ELISA检测血清中细胞因子
5.3.2 PBMCs和外周血白细胞增殖活性
5.3.3 LPS激活PBMCs和外周血白细胞增殖活性
5.3.4 HA和HI试验检测血清抗体滴度
5.4 讨论
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3770794
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
主要符号对照表
第一章 绪论
1.1 乳酸菌概述
1.2 乳酸菌活载体表达系统
1.2.1 宿主菌的选择
1.2.2 乳酸菌表达方式的选择
1.2.3 乳酸菌表达系统的优势及展望
1.3 免疫佐剂及免疫增强剂
1.3.1 免疫增强剂的定义及分类
1.3.2 免疫增强剂的作用机制
1.3.3 免疫佐剂的定义及分类
1.3.4 免疫佐剂的作用机制
1.3.5 免疫佐剂及免疫增强剂的研究现状及展望
1.4 禽β-防御素概述
1.4.1 禽β-防御素的定义及分类
1.4.2 禽β-防御素的免疫学功能
1.4.3 禽β-防御素作为免疫佐剂或免疫增强剂的研究进展及展望
1.4.4 新城疫灭活疫苗及其免疫佐剂
1.4.5 新城疫活疫苗及其免疫佐剂
1.5 目的与意义
第二章 表达禽β-防御素的重组乳酸菌的构建
2.1 材料
2.1.1 质粒和菌株
2.1.2 主要试剂和仪器
2.2 方法
2.2.1 引物设计及合成
2.2.2 目的片段的线性扩增
2.2.3 目的片段的胶回收
2.2.4 宿主菌株NZ3900感受态的制备
2.2.5 重组质粒pNZ8149-Av BDs构建
2.2.6 重组质粒pNZ8149-Nis RK-Cm-Av BDs的构建
2.2.7 重组质粒pNZ2103-Av BDs构建
2.2.8 重组乳酸菌的构建
2.2.9 重组乳酸菌的鉴定
2.2.10 重组乳酸菌的诱导表达
2.3 结果
2.3.1 目的基因片段的扩增
2.3.2 重组乳酸菌r-L.Lactis-pNZ8149-AvBDs的筛选及PCR鉴定
2.3.3 重组乳酸菌r-L.Lactis-pNZ8149-NisRK-Cm-Av BDs的筛选及PCR鉴定
2.3.4 重组乳酸菌r-L.Lactis-pNZ2103-AvBDs的筛选及PCR鉴定
2.3.5 重组乳酸菌r-L.Lactis-pNZ8149-AvBDs目的蛋白的表达鉴定
2.3.6 重组乳酸菌r-L.Lactis-pNZ8149-NisRK-Cm-Av BDs目的蛋白的表达鉴定
2.3.7 重组乳酸菌r-L.Lactis-pNZ2103-AvBDs目的蛋白的表达鉴定
2.4 表达禽β-防御素重组乳酸菌菌体裂解混合物的制备
2.5 讨论
第三章 重组禽β-防御素体外免疫调节活性的检测
3.1 材料
3.1.1 细胞
3.1.2 主要试剂及仪器
3.2 方法
3.2.1 重组禽β-防御素激活J774-DualTM报告细胞系免疫信号通路的检测
3.2.2 重组β-防御素刺激PBMCs产生细胞因子的检测
3.2.3 重组β-防御素刺激鸡巨噬细胞(HD11)产生细胞因子的检测
3.3 结果
3.3.1 重组禽β-防御素激活J774-DualTM报告细胞系免疫信号通路的检测
3.3.2 重组β-防御素刺激PBMCs产生细胞因子的检测
3.3.3 重组β-防御素激活PBMCs CD80及CD86 分子的检测
3.3.4 重组β-防御素激活HD11IL-10的检测
3.3.5 重组β-防御素激活HD11 CD80和CD86 分子的检测
3.4 讨论
第四章 重组β-防御素作为新城疫活疫苗免疫佐剂的初步研究
4.1 材料
4.1.1 毒株、动物及疫苗
4.1.2 主要试剂与仪器
4.2 方法
4.2.1 新城疫活疫苗、重组β-防御素免疫佐剂制备及注射剂量
4.2.2 动物实验设计方案
4.2.3 血凝试验和血凝抑制试验检测血清抗体滴度
4.2.4 ELISA检测血清细胞因子的含量
4.2.5 PBMCs和外周血白细胞的活性检测
4.3 结果
4.3.1 ELISA检测血清中细胞因子
4.3.2 PBMCs和外周血白细胞增殖活性
4.3.3 LPS激活PBMCs和外周血白细胞增殖活性检测
4.3.4 NDV攻毒PBMCs和外周血白细胞后增殖活性检测
4.3.5 HA和HI试验检测血清抗体滴度
4.4 讨论
第五章 重组β-防御素作为新城疫油乳剂灭活疫苗免疫佐剂的研究
5.1 材料
5.1.1 毒株、动物及疫苗
5.1.2 主要试剂与仪器
5.2 方法
5.2.1 重组β-防御素免疫佐剂新城疫灭活疫苗的制备及注射剂量
5.2.2 动物实验设计方案
5.2.3 血凝试验和血凝抑制试验检测血清抗体滴度
5.2.4 ELISA检测血清细胞因子的含量
5.2.5 PBMCs和外周血白细胞的增殖活性检测
5.3 结果
5.3.1 ELISA检测血清中细胞因子
5.3.2 PBMCs和外周血白细胞增殖活性
5.3.3 LPS激活PBMCs和外周血白细胞增殖活性
5.3.4 HA和HI试验检测血清抗体滴度
5.4 讨论
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3770794
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