酸性红73间接ELISA检测方法的建立及初步应用

发布时间：2023-03-30 00:32

　　酸性红73(AR73)是一种化学合成的红色偶氮染料，主要用于羊毛、丝织物、皮革和染发产品之中。然而由于其有较强的着色能力，一些食品加工企业往往将其非法作为虾、肉等食品着色剂使用。有研究表明AR73具有强致癌性，如果食品中残留极微量的染料也会对人体健康产生很大危害。因此，世界很多国家已明令禁止将其作为食品着色剂使用。目前，有关ELISA检测虾仁中AR73的方法尚未报道。本研究拟首次建立一种ELISA方法用来检测虾仁中的AR73。 本文分别采用活性酯法和N，N-羰基二咪唑(CDI)法合成了酸性红73(AR73)的免疫原和包被原，AR73与牛血清白蛋白(BSA)的偶联比分别为12:1和6:1，与卵清蛋白(OA)的偶联比分别为13:1和3:1，经免疫动物获得了多克隆抗体。然后分别采用饱和硫酸铵法和辛酸-硫酸铵法纯化了兔抗AR73IgG。通过二喹啉甲酸(BCA)法、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试验、间接ELISA法分别测定IgG的浓度、纯度及效价。试验结果显示，饱和硫酸铵法所提IgG浓度为36.44mg/mL,最高效价达1.6×105；辛酸-硫酸铵法所提IgG浓度为15...

【文章页数】：57 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 酸性红 73 的概述
    2 酸性红 73 的研究现状
        2.1 酸性红 73 的危害
        2.2 残留特性及检测方法
        2.3 合成人工抗原的方法
    3 研究内容、目标及意义
        3.1 研究内容
        3.2 研究目标
        3.3 拟解决的关键问题
        3.4 研究意义
第二章 酸性红 73 人工抗原的合成与鉴定
    1 材料
        1.1 试剂与药品
        1.2 仪器与设备
        1.3 溶液系统
    2 方法
        2.1 人工抗原的合成
            2.1.1 活性酯法
            2.1.2 N，N-羰基二咪唑(CDI)法
        2.2 人工抗原的鉴定
            2.2.1 人工抗原浓度的测定
            2.2.2 紫外分光光度法
            2.2.3 SDS-PAGE 法
    3 结果
        3.1 人工抗原浓度测定结果
        3.2 紫外分光光度法鉴定结果
            3.2.1 免疫原 AR73-HS-BSA 鉴定结果
            3.2.2 包被原 AR73-HS-OA 鉴定结果
            3.2.3 免疫原 AR73-BSA 鉴定结果
            3.2.4 包被原 AR73-OA 鉴定结果
        3.3 SDS-PAGE 法鉴定结果
    4 讨论
        4.1 人工抗原的浓度
        4.2 AR73 的半抗原与偶联物
    5 结论
第三章 AR73 多克隆抗体的制备与纯化
    1 材料
        1.1 试剂与药品
        1.2 仪器和设备
        1.3 实验动物
        1.4 溶液系统
    2 方法
        2.1 多克隆抗体的制备
        2.2 多克隆抗体纯化方法的比较
            2.2.1 饱和硫酸铵法
            2.2.2 辛酸-硫酸铵法
            2.2.3 改良 BCA 法测 IgG 浓度
            2.2.4 SDS-PAGE 测 IgG 纯度
            2.2.5 间接 ELISA 方法测 IgG 效价
        2.3 多克隆抗体的筛选
            2.3.1 双向琼脂扩散法
            2.3.2 筛选血清 IgG 组分的提取
    3 结果
        3.1 两种纯化方法的比较
            3.1.1 IgG 浓度的比较结果
            3.1.2 IgG 纯度的测定
            3.1.3 IgG 效价的比较结果
        3.2 多克隆抗体的筛选结果
            3.2.1 双向琼脂扩散实验结果
            3.2.2 筛选血清的分离纯化结果
    4 讨论
        4.1 多克隆抗体的纯化方法
        4.2 多克隆抗体的筛选
    5 结论
第四章 间接 ELISA 检测方法的建立及其应用
    1 材料
        1.1 试剂与药品
        1.2 仪器与设备
        1.3 溶液系统
    2 方法
        2.1 间接 ELISA 方法的建立
            2.1.1 最佳组合与最适工作浓度的选择
            2.1.2 间接 ELISA 方法标准曲线的建立
        2.2 间接 ELISA 方法反应体系的优化
            2.2.1 酶标板均一性的测定
            2.2.2 包被液及包被方式的选择
            2.2.3 封闭液的筛选
            2.2.4 抗体稀释液及温育时间的确定
            2.2.5 酶标二抗稀释倍数与反应时间的选择
            2.2.6 底物反应体系及温育时间的优化
            2.2.7 优化后 ELISA 方法的重新建立
            2.2.8 ELISA 方法的特异性检测
        2.3 样品制备及添加回收率的计算
            2.3.1 样品的制备
            2.3.2 添加回收率的计算
            2.3.3 实际样品的检测
    3 结果
        3.1 间接 ELISA 方法的建立
            3.1.1 最佳组合与最适工作浓度的确定
            3.1.2 标准曲线的建立
        3.2 ELISA 方法的优化结果
            3.2.1 酶标板均一性测定结果
            3.2.2 包被液及包被方式的确定
            3.2.3 封闭液的确定
            3.2.4 抗体稀释液及温育时间的优化
            3.2.5 酶标二抗稀释倍数与反应时间的选择
            3.2.6 底物及反应时间的确定
            3.2.7 间接 ELISA 方法的重新建立
            3.2.8 特异性测定结果
        3.3 样品制备及添加回收率的计算
            3.3.1 AR73 样品制备
            3.3.2 准确性的测定
            3.3.3 实际样品检测结果
    4 讨论
        4.1 间接 ELISA 方法的优化
        4.2 间接 ELISA 方法的特异性和准确度
    5 结论
全文结论
    1 主要结论
    2 本文章存在的不足
参考文献
致谢
攻读硕士期间发表或录用的论文



本文编号：3774815