Mt功能变化和焦亡相关蛋白表达在HEV致肝脏损伤中的作用

发布时间：2023-04-01 00:29

　　为了进一步揭示戊型肝炎病毒(HEV)的致病机制,本研究利用已建立的沙鼠感染猪源HEV模型,通过real-time qPCR、组织病理学、超微病理学、免疫组织化学、免疫电镜、western-blotting、 ELISA等方法,对HEV感染沙鼠后,在血液、粪便及全身各组织中HEV病毒载量及其抗原的分布规律进行了观察研究。对猪源HEV对沙鼠肝脏及肝细胞内线粒体的结构和功能造成的影响进行深入研究。重点对线粒体结构、功能和凋亡通路的相关蛋白及引起细胞焦亡的关键蛋白进行了定位和定量研究。研究结果如下： 1.在沙鼠感染HEV后,对血液、粪便及全身各组织器官中HEVRNA进行real-time qPCR检测的结果显示,在各感染阶段HEV RNA在沙鼠血液、粪便及全身各组织都有不同水平复制和增殖,其中肝和肠道为HEV RNA复制和增殖最活跃的组织,且在肠道内HEV检测阳性持续时间最长、HEV RNA拷贝数最高。对HEV抗原动态监测显示,HEV抗原在全身各组织内均有不同水平的表达。其中HEV抗原在肝、脾、肠道内表达的时间最长,HEV-ORF2在肝脏内感染后28d表达量最高,在肠道内感染后21d表达量最高...

【文章页数】：131 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
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第一章 文献综述
    1 戊型肝炎病毒病原学
        1.1 分类学
        1.2 分子形态学及理化特征
        1.3 病毒基因组及病毒蛋白
        1.4 病毒晶体结构
    2 HEV的流行病学
        2.1 HEV的地理分布
        2.2 人HEV的流行
        2.3 猪HEV的流行
        2.4 兔HEV的流行
        2.5 禽HEV的流行
        2.6 其他动物HEV的流行
    3 HEV传播途径
        3.1 粪口途径
        3.2 血液传播
        3.3 接触感染动物传播
        3.4 垂直传播
    4 戊型肝炎临床症状
    5 HEV的动物模型
        5.1 非人灵长类动物模型
        5.2 猪动物模型
        5.3 鼠动物模型
        5.4 兔动物模型
        5.5 鸡动物模型
    6 线粒体研究进展
        6.1 线粒体的结构
        6.2 线粒体的功能
        6.3 线粒体基因组
        6.4 线粒体凋亡
    7 细胞焦亡
        7.1 细胞焦亡的发现
        7.2 细胞焦亡的形态学变化
        7.3 细胞焦亡的机制
        7.4 细胞焦亡炎症相关因子
        7.5 细胞焦亡的影响
    8 本研究的目的与意义
第二章 猪源HEV RNA及抗原在长爪沙鼠组织器官中的分布
    试验一 猪源HEV毒株分离鉴定
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果
            2.1 猪肝脏内HEV PCR检测结果
            2.2 猪肝脏组织病理学观察
            2.3 猪肝脏内HEV ORF2抗原检测
        3 讨论
    试验二 猪源HEV感染长爪沙鼠组织器官中HEV病毒载量检测
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果
            2.1 病毒悬液HEV RNA巢式PCR检测结果
            2.2 标准品的制备与鉴定
            2.3 标准曲线的制作
            2.4 接种沙鼠病毒液中HEV载量测定
            2.5 沙鼠接种HEV后血清中HEV RNA阳性沙鼠数量
            2.6 沙鼠接种HEV后粪便中HEV RNA阳性沙鼠数量
            2.7 沙鼠接种HEV后各组织器官中HEV RNA阳性沙鼠数量
            2.8 沙鼠接种HEV后血清、粪便、各组织器官中HEV载量
            2.9 沙鼠血清HEV IgG检测结果
        3 讨论
    试验三 Western-blotting检测HEV ORF3抗原在沙鼠组织器官中的定量分布
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果
        3 讨论
    试验四 HEV ORF2及ORF3抗原在沙鼠肝脏和肠道内免疫组织化学定位
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果
            2.1 HEV ORF2抗原在沙鼠肝脏内的定位
            2.2 HEV ORF3抗原在沙鼠肝脏内的定位
            2.3 HEV ORF2抗原在沙鼠肠道内的定位
            2.4 HEV ORF3抗原在沙鼠肠道内的定位
        3 讨论
    试验五 猪源HEV ORF3抗原在长爪沙鼠肝细胞内超微结构的定位
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果
        3 讨论
        小结
第三章 HEV感染对沙鼠肝脏功能及结构的影响
    前言
    试验一 HEV感染对沙鼠肝脏功能的影响
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
            1.3 数据分析
        2 结果
            2.1 HEV感染对ALT浓度的影响
            2.2 HEV感染对AST浓度的影响
            2.3 HEV感染对T-BIL浓度的影响
            2.4 HEV感染对I-BIL浓度的影响
            2.5 HEV感染对D-BIL浓度的影响
        3 讨论
    试验二 HEV感染对沙鼠肝细胞抗氧化能力的影响
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果
            2.1 SOD活性检测结果
            2.2 MDA含量检测结果
        3 讨论
    试验三 HEV感染对沙鼠肝脏结构的影响
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果
            2.1 沙鼠肝脏器官指数
            2.2 沙鼠肝脏病理组织学变化
        3 讨论
    试验四 HEV感染对沙鼠肝细胞超微结构的影响
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果
            2.1 肝细胞超微结构观察
            2.2 肝细胞线粒体横纵径长度统计
        3 讨论
        小结
第四章 HEV感染对沙鼠肝细胞线粒体结构和功能的影响
    前言
    试验一 HEV感染对沙鼠肝细胞线粒体ATP合成与利用的影响
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果
            2.1 ATP合成酶在肝脏中定位分析及阳性面密度统计
            2.2 ATP合成酶在肝脏中半定量分析
            2.3 肝脏中ATP酶含量分析
        3 讨论
    试验二 HEV感染对沙鼠肝细胞线粒体电子传递功能的影响
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果
            2.1 NOX4在肝脏中定位分析及阳性面密度统计
            2.2 NOX4在肝脏中定量分析
            2.3 CytC在肝脏中定位分析及阳性面密度统计
            2.4 CytC在肝脏中定量分析
        3 讨论
    试验三 HEV感染对沙鼠肝细胞线粒体相关基因核酸序列的影响
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果
            2.1 沙鼠肝脏线粒体CytB基因扩增结果
            2.2 沙鼠肝脏线粒体D-loop基因扩增结果
            2.3 沙鼠肝脏线粒体CytC基因扩增结果
        3 讨论
        小结
第五章 HEV感染对沙鼠肝细胞线粒体凋亡通路相关蛋白的影响
    前言
    1 材料与方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 结果
        2.1 TUNEL染色结果
        2.2 线粒体及细胞浆内CytC蛋白定量分析
        2.3 感染沙鼠肝脏内Bcl-2和Bax蛋白定位分析
        2.4 感染沙鼠肝脏内Bcl-2和Bax蛋白定量分析
        2.5 感染沙鼠肝脏内Apaf-1蛋白定位分析
        2.6 感染沙鼠肝脏内Apaf-1蛋白定量分析
        2.7 感染沙鼠肝脏内Caspase3蛋白定位分析
        2.8 感染沙鼠肝脏内Caspase3蛋白定量分析
        2.9 感染沙鼠肝脏内Caspase9蛋白定位分析
        2.10 感染沙鼠肝脏内Caspase9蛋白定量分析
    3 讨论
    小结
第六章 HEV感染对沙鼠肝细胞焦亡及炎症相关因子的影响
    前言
    1 材料与方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 结果
        2.1 沙鼠肝脏中Caspase1蛋白定位分析
        2.2 沙鼠肝脏中Caspase1蛋白定量分析
        2.3 沙鼠肝脏中IL-1β蛋白定位分析
        2.4 沙鼠肝脏中IL-1β蛋白定量分析
        2.5 沙鼠肝脏中IL-18蛋白定位分析
        2.6 沙鼠肝脏中IL-18蛋白定量分析
        2.7 沙鼠肝脏中TNF-α蛋白定位分析
        2.8 沙鼠肝脏中TNF-α蛋白定量分析
        2.9 沙鼠肝脏中INFγ含量检测结果
    3 讨论
    小结
结论
本研究创新点
参考文献
图版与说明
附录
致谢
作者简介



本文编号：3776094