Ⅰ型干扰素受体在鸡消化道各器官的载量与分布

发布时间：2023-04-01 06:46

　　干扰素(interferon, IFN)是由生物体细胞受到病毒或其它诱生剂的作用而产生的分泌性糖蛋白，具有广泛生物学活性，如抗病毒、抗细胞增殖、免疫调节等多种生物学活，是机体防御系统的重要组成部分。干扰素按其与受体结合的原则，分为I型和II型，后来发现I型干扰素按其与抗体结合的抗原性不同又可分为两类，故把I型干扰素又分为α、β两大类，将原来的II型干扰素命名为γ。IFN-α和IFN-β的分子有序列同源性，共用相同的细胞表面受体——I型干扰素受体（IFNAR），IFN-γ是一种同源二聚体糖蛋白，其细胞表面受体为II型干扰素受体(IFNGR)。I型干扰素受体由两条链组成，α链（IFNAR-1）和β链(IFNAR-2)，IFNAR-1的生物学功能与干扰素结合以及生物信号传导有关，而IFNAR-2的生物学功能尚未清楚。 IFNAR-1是IFNAR的一个重要亚单位蛋白，在干扰素与干扰素受体结合的过程中发挥着重要的作用，因此，研究IFNAR-1在鸡消化道各器官的分布对分析干扰素在消化道作用及吸收的部位有重要的意义。本实验从两方面来检测IFNAR-1在消化道各器官的分布：一是基因层面，二是蛋白层面。...

【文章页数】：81 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
英文缩略词表
中文摘要
Abstract
前言
    1.1 干扰素概述
        1.1.1 干扰素的来源和分类
        1.1.2 干扰素的性质和生物学特性
    1.2 干扰素的生物功能和作用机制
    1.3 干扰素发挥作用的信号转导通路
    1.4 干扰素在临床兽医中的应用
    1.5 干扰素受体的概述
        1.5.1 干扰素受体的分类及作用
        1.5.2 Ⅰ型干扰素受体的结构
        1.5.3 Ⅱ 型干扰素受体的结构
    1.6 干扰素受体的信号传导
        1.6.1 干扰素受体的信号传导途径
        1.6.2 干扰素受体的第二信使
    1.7 实时荧光定量 PCR
        1.7.1 实时荧光定量 PCR 的分类
        1.7.2 实时荧光定量 PCR 的定量方法
        1.7.3 实时荧光定量 PCR 的应用
        1.7.4 荧光定量 PCR 的优点
    1.8 绿色荧光蛋白
    1.9 研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 病毒、细胞及干扰素
        2.1.2 实验试剂及耗材
        2.1.3 质粒及受体菌
        2.1.4 主要仪器
        2.1.5 试验所用溶液及其配制
    2.2 试验方法
        2.2.1 标准阳性质粒的制备
            2.2.1.1 设计引物
            2.2.1.2 IFNAR-1 基因 RNA 的提取
            2.2.1.3 IFNAR-1 基因部分片段的 RT-PCR 扩增
            2.2.1.4 IFNAR-1 基因部分片段 PCR 产物的纯化回收
            2.2.1.5 目的基因的连接转化及鉴定
                2.2.1.5.1 目的基因与 pMD18-T 载体的连接体系
                2.2.1.5.2 大肠杆菌感受态细胞（E.coli DH5α）的制备
                2.2.1.5.3 连接产物转化
            2.2.1.6 重组质粒 DNA 的提取
            2.2.1.7 重组质粒的鉴定
            2.2.1.8 阳性克隆序列的测序
        2.2.2 内参基因质粒标准品的制备
        2.2.3 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 的建立
            2.2.3.1 质粒标准品原始定量
            2.2.3.2 荧光定量 PCR 反应条件的优化
            2.2.3.3 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR 的反应体系及程序
            2.2.3.4 标准曲线的建立
        2.2.4 临床样品检测
            2.2.4.1 组织样本的采集
            2.2.4.2 临床样品组织中 RNA 的提取
            2.2.4.3 反转录反应
            2.2.4.4 实时荧光定量 PCR 检测不同器官的 IFNAR-1 的拷贝量
        2.2.5 蛋白吸附实验
            2.2.5.1 鸡 IFN-β基因的克隆
                2.2.5.1.1 引物设计
                2.2.5.1.2 鸡 IFN-β基因组织 RNA 的提取
                2.2.5.1.3 IFNβ基因部分片段的 RT-PCR 扩增
                2.2.5.1.4 IFN-β基因部分片段 PCR 产物的纯化回收
            2.2.5.2 构建 pMD-IFN-β载体
                2.2.5.2.1 目的基因与 pMD18-T 的连接
                2.2.5.2.2 连接产物转化
                2.2.5.2.3 重组质粒 DNA 的提取
                2.2.5.2.4 重组质粒的鉴定
                2.2.5.2.5 阳性克隆序列的测序
            2.2.5.3 构建 pEGFP-N1- IFN-β载体
                2.2.5.3.1 酶切 pMD-IFN-β和 pEGFP-N1 空载体
                2.2.5.3.2 连接
                2.2.5.3.3 连接产物转化
                2.2.5.3.4 阳性克隆的鉴定
                2.2.5.3.5 阳性克隆序列测序
            2.2.5.4 PCR 扩增 IFN-β+GFP 融合基因
            2.2.5.5 构建 pcDNA3.1-N1-IFN-β+GFP 载体
                2.2.5.5.1 PCR 产物的纯化回收
                2.2.5.5.2 融合基因 IFN-β+GFP 与 pcDNA3.1-N1 载体的连接
                2.2.5.5.3 连接产物转化
                2.2.5.5.4 阳性克隆的鉴定
                2.2.5.5.5 阳性克隆序列测序
            2.2.5.6 重组质粒 pcDNA3.1-N1-IFN-β+GFP 的提取
            2.2.5.7 293T 细胞的制备
            2.2.5.8 IFN-β+GFP 融合基因的真核表达
                2.2.5.8.1 真核表达载体的转染
                2.2.5.8.2 倒置荧光显微镜检测重组 IFN-β+GFP 蛋白的瞬时表达
            2.2.5.9 镍柱纯化融合蛋白
            2.2.5.10 表达的重组 IFN-β+GFP 蛋白的 Western blot 鉴定
            2.2.5.11 合蛋白的除盐、浓度测定
            2.2.5.12 切片的制备
            2.2.5.13 融合蛋白 IFN-β+GFP 浸润切片显色
        2.2.6 口服干扰素及干扰素抗病毒活性的检测
3 结果与分析
    3.1 反转录或得 IFNAR-1 部分基因
    3.2 pMD-IFNAR-1 和 pMD-β-actin 质粒的 PCR 鉴定
    3.3 荧光定量 PCR 反应条件的优化
    3.4 荧光定量 PCR 检测 IFNAR-1、β-actin 基因标准曲线的建立
    3.5 临床样品的检测结果
    3.6 反转录或得 IFN-β基因
    3.7 pEGFP-N1- IFN-β质粒的双酶切鉴定
    3.8 PCR 扩增 IFN-β和 GFP 融合基因
    3.9 pcDNA3.1-N1- IFN-β-GFP 载体的双酶切鉴定
    3.10 倒置荧光显微镜检测重组 IFN-β+GFP 蛋白的瞬时表达
    3.11 Western -Blot 检测 IFN-β+GFP 融合蛋白
    3.12 考马斯亮蓝法测定重组蛋白的浓度
        3.12.1 标准曲线的绘制
        3.12.2 蛋白质待测样品液测定结果
    3.13 融合蛋白 IFN-β-GFP 浸润切片显色
    3.14 口服干扰素及干扰素抗病毒活性的检测
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢



本文编号：3776650