猪繁殖与呼吸综合征病毒不同变异株RT-PCR鉴别诊断方法的建立及流行病学调查

发布时间：2023-04-01 15:54

　　猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV）引起的一种高度传染性疾病，可导致妊娠母猪流产、早产、死胎、木乃伊胎等繁殖性能障碍以及各年龄段猪的呼吸系统功能障碍。 2006年我国发生的“猪高热综合征”(porcine high fever syndrome, PHFS)，经鉴定其病原为NSP2基因高变区发生了不连续的90bp缺失的高致病PRRSV（HP-PRRSV）。最新研究表明高致病性PRRSV除具有不连续90bp的缺失情况以外，还在与本缺失区域相近的位置存在有36bp或57bp的缺失情况（以下将这几种缺失情况分别称为90bp缺失、36bp缺失和57bp缺失）。本研究建立一种鉴别不同变异株的RT-PCR方法，用该方法对目前PRRSV不同变异毒株的流行情况进行调查研究，以摸清临床PRRSV变异毒株的流行情况。 根据本实验室的研究结果及GenBank上已公布的序列，设计引物，...

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符号说明
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 病原学
    1.2 分子生物学特征
    1.3 蛋白组学特征
        1.3.1 PRRSV 的非结构蛋白
        1.3.2 PRRSV 的结构蛋白
            1.3.2.1 次要结构蛋白
            1.3.2.2 GP5 蛋白
            1.3.2.3 M 蛋白
            1.3.2.4 N 蛋白
    1.4 流行病学
    1.5 致病力
    1.6 PRRSV 的致病机制
    1.7 组织病理学变化
    1.8 PRRSV 遗传变异
    1.9 诊断
        1.9.1 血清学检测
            1.9.1.1 酶联免疫吸附试验（ELISA)
            1.9.1.2 血清中和试验(SNT)
            1.9.1.3 间接荧光抗体试验(IFA)
            1.9.1.4 免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)
        1.9.2 分子生物学检测
    1.10 PRRSV 的防治
        1.10.1 建立防控部门，做好保障工作
        1.10.2 做好宣传工作，普及科学防治知识
        1.10.3 密切监测疫情，及时准确掌握疫情动态
        1.10.4 结合实际，采取预防措施
            1.10.4.1 提高饲养管理水平，改善猪舍环境
            1.10.4.2 重视引种，净化猪群
            1.10.4.3 科学制定消毒程序，防止病原菌扩散
            1.10.4.4 严抓疫苗免疫，提高猪只抵抗力
    1.11 本研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 试验材料和仪器
        2.1.1 样品
        2.1.2 载体、菌株与细胞
        2.1.3 试剂
        2.1.4 主要设备及仪器
    2.2 PRRSV 不同变异株鉴别诊断方法的建立
        2.2.1 病毒增殖
            2.2.1.1 细胞系 Marc-145 的培养及传代
            2.2.1.2 病毒接种
        2.2.2 引物设计
        2.2.3 病料及血清样品 RNA 提取
        2.2.4 RT-PCR 反应
        2.2.5 套式 PCR 反应
        2.2.6 套式 PCR 产物的克隆及序列分析鉴定
            2.2.6.1 PCR 产物纯化回收
            2.2.6.2 PCR 产物与克隆载体 pJET1.2 连接反应
            2.2.6.3 用氯化钙制备感受态细胞 TOP10
            2.2.6.4 转化反应
            2.2.6.5 重组质粒 DNA 的提取
            2.2.6.6 重组质粒 DNA 的 PCR 鉴定
            2.2.6.7 重组质粒 DNA 酶切鉴定
            2.2.6.8 重组质粒的测序验证
        2.2.7 方法检验
            2.2.7.1 特异性试验
            2.2.7.2 重复性试验
            2.2.7.3 敏感性试验
            2.2.7.4 方法应用检验
    2.3 流行性病学调查
        2.3.1 材料方法
        2.3.2 技术路线
        2.3.3 RNA 浓度测定
        2.3.4 RT-PCR 反应
        2.2.5 套式 PCR 反应
3 结果
    3.1 标准毒 RNA 浓度测定表
    3.2 PRRSV 经典株与高致病毒株单独感染与混合感染检测图
    3.3 标准毒株重组质粒 PCR 及酶切鉴定
    3.4 重组质粒的测序验证
    3.5 方法检验
        3.5.1 特异性试验
        3.5.2 重复性试验
        3.5.3 敏感性试验
    3.6 方法应用
        3.6.1 样品检测
        3.6.2 PCR 产物重组质粒鉴定
        3.6.3 测序验证
    3.7 流行性病学调查
        3.7.1 样品 RNA 浓度测定表
        3.7.2 流行性病学调查
        3.7.3 流行性病学调查结果统计
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢



本文编号：3777426