MDCK细胞表达鸡ST3GAL I基因对H9亚型禽流感病毒增殖情况的影响
发布时间：2023-04-02 00:39
流感病毒能否感染宿主主要取决于流感病毒血凝素(hemagglutinin, HA)对宿主细胞表面受体的识别与结合。流感病毒通常识别的有唾液酸α2,3半乳糖(SAα2,3Gal)和唾液酸α2,6半乳糖(SAα2,6Gal)两种受体类型。大多数禽流感病毒倾向于识别SAa2,3Gal受体,而人流感病毒则倾向于识别含有SAα2,6Gal的受体。病毒受体的种类差异对病毒的感染和复制有着重大的影响能力。MDCK细胞为流感病毒疫苗生产的重要细胞系之一。经检测发现,MDCK细胞既表达SAα2,3Gal,又表达SAα2,6Gal。禽流感病毒的HA主要结合SAα2,3Gal,但MDCK细胞上这种受体丰度并不高,导致禽流感病毒在这种细胞中的病毒滴度低。α-2,3-唾液酸转移酶I(ST3GAL I)能够特异催化细胞表面α2,3糖苷键连接结构的形成。因此,本研究克隆了ST3GAL I基因的完整ORF区,将其定向连接至pcDNA3.1 (+)真核表达载体,构建了高效真核表达ST3GALI质粒,命名为pcDNA3.1-ST3GAL I。将pcDNA3.1-ST3GAL I真核表达质粒瞬时转染MDCK细胞,半定量RT...
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
缩略词表
文献综述
1 禽流感病毒概述
1.1 禽流感病毒形态结构
1.2 禽流感基因组结构及其编码蛋白
2 H9亚型禽流感流行情况
2.1 国外流行情况
2.2 国内流行情况
3 禽流感疫苗的研究进展
3.1 全病毒灭活疫苗
3.2 重组活载体疫苗
3.3 亚单位疫苗
3.4 核酸疫苗
3.5 反义基因工程疫苗
3.6 新型流感疫苗
4 流感病毒受体研究
4.1 流感病毒受体的性质
4.2 与唾液酸受体相关的酶类
4.2.1 唾液酸酶
4.2.2 唾液酸转移酶
5 流感病毒受体分布及作用
5.1 禽类
5.1.1 水禽类
5.1.2 陆地禽类
5.2 哺乳动物类
5.3 人类
6 影响流感病毒与细胞受体结合的因素
6.1 唾液酸的键合类型和糖链的结构
6.2 HA受体结合位点
6.3 其他因素
引言
试验一 鸡α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ基因的克隆、序列分析及真核表达载体的构建
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 载体和菌株
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器
1.1.4 试剂的配制
1.1.4.1 琼脂糖凝胶电泳试剂配制
1.1.4.2 大肠杆菌转化用溶液
1.1.4.3 焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液的配制
1.1.4.4 感受态细胞制备
1.2 方法
1.2.1 鸡ST3GAL Ⅰ基因的克隆
1.2.1.1 鸡ST3GAL Ⅰ基因的引物设计与合成
1.2.1.2 鸡肠道组织总RNA的提取
1.2.1.3 cDNA第一链合成
1.2.1.4 鸡ST3GAL Ⅰ基因的PCR扩增
1.2.1.5 PCR产物的回收与纯化
1.2.1.6 重组克隆质粒的构建
1.2.1.7 重组质粒的鉴定
1.2.1.8 鸡ST3GAL Ⅰ基因生物信息学分析
1.2.2 pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ真核表达载体的构建
1.2.2.1 引物的设计及合成
1.2.2.2 鸡ST3GAL Ⅰ基因的扩增
1.2.2.3 PCR产物的纯化回收
1.2.2.4 PCR产物和pcDNA3.1(+)载体的酶切回收
1.2.2.5 目的基因与表达载体的连接
1.2.2.6 连接产物的转化
1.2.2.7 重组质粒的鉴定
2 结果与分析
2.1 鸡ST3GAL Ⅰ基因的RT-PCR扩增结果
2.2 重组克隆质粒pGEM-ST3GAL Ⅰ的鉴定
2.3 鸡ST3GAL Ⅰ基因测序结果及序列分析
2.4 不同物种ST3Gal Ⅰ基因的同源性分析
2.5 重组真核表达质粒pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ的鉴定
3 讨论
试验二 MDCK细胞转染条件的优化及pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ在MDCK细胞上的表达
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒和细胞
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器
1.1.4 所需溶液配制
1.2 方法
1.2.1 pcDNA3.1-EGFP重组质粒的构建
1.2.1.1 引物的设计及合成
1.2.1.2 EGFP基因的扩增
1.2.1.3 PCR产物的纯化回收
1.2.1.4 PCR产物和pcDNA3.1(+)载体的酶切回收
1.2.1.5 目的基因与表达载体的连接
1.2.1.6 连接产物的转化
1.2.1.7 重组表达质粒的鉴定
1.2.2 MDCK细胞转染条件优化
1.2.2.1 细胞准备
1.2.2.2 无内毒素质粒制备
1.2.2.3 pcDNA3.1-EGFP质粒转染MDCK细胞
1.2.2.4 质粒与脂质体比例对转染效率的影响
1.2.2.5 质粒用量对转染效率的影响
1.2.2.6 细胞密度对转染效率的影响
1.2.3 pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ真核表达载体在MDCK细胞的表达
1.2.4 RT-PCR检测ST3GALⅠ基因mRNA转录水平表达
1.2.4.1 内参基因合成
1.2.4.2 细胞总RNA的提取
1.2.4.3 RNA中DNA的消化
1.2.4.4 总RNA含量测定
1.2.4.5 cDNA的合成
1.2.4.6 ST3GALⅠ基因的扩增
1.2.4.7 内参GAPDH基因的扩增
2 结果与分析
2.1 pcDNA3.1-EGFP真核表达质粒的鉴定
2.1.1 重组质粒pcDNA3.1-EGFP质粒PCR鉴定
2.1.2 重组质粒pcDNA3.1-EGFP酶切鉴定
2.2 pcDNA3.1-EGFP质粒转染MDCK细胞条件优化
2.2.1 质粒与脂质体比例对转染效率的影响
2.2.2 质粒用量对转染效率的影响
2.2.3 细胞密度对转染效率的影响
2.3 RT-PCR检测转染MDCK细胞后ST3GAL Ⅰ基因mRNA转录水平表达
2.3.1 细胞总RNA完整性及纯度检测
2.3.2 RT-PCR检测ST3GAL基因mRNA转录水平表达
3 讨论
试验三 H9亚型禽流感病毒在过表达ST3GAL Ⅰ基因的MDCK细胞上的增殖情况
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 毒株
1.1.2 细胞与质粒
1.1.3 主要试剂
1.1.4 主要仪器
1.1.5 所需试剂配制
1.2 方法
1.2.1 H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上的增殖
1.2.2 H9亚型禽流感病毒HA试验
1.2.3 H9亚型禽流感病毒TCID50的测定
2 结果
2.1 转染组与未转染组CPE结果
2.2 HA结果
2.3 TCID50测定结果
3 讨论
全文总结
参考文献
英文摘要
附录
本文编号：3778175
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
缩略词表
文献综述
1 禽流感病毒概述
1.1 禽流感病毒形态结构
1.2 禽流感基因组结构及其编码蛋白
2 H9亚型禽流感流行情况
2.1 国外流行情况
2.2 国内流行情况
3 禽流感疫苗的研究进展
3.1 全病毒灭活疫苗
3.2 重组活载体疫苗
3.3 亚单位疫苗
3.4 核酸疫苗
3.5 反义基因工程疫苗
3.6 新型流感疫苗
4 流感病毒受体研究
4.1 流感病毒受体的性质
4.2 与唾液酸受体相关的酶类
4.2.1 唾液酸酶
4.2.2 唾液酸转移酶
5 流感病毒受体分布及作用
5.1 禽类
5.1.1 水禽类
5.1.2 陆地禽类
5.2 哺乳动物类
5.3 人类
6 影响流感病毒与细胞受体结合的因素
6.1 唾液酸的键合类型和糖链的结构
6.2 HA受体结合位点
6.3 其他因素
引言
试验一 鸡α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ基因的克隆、序列分析及真核表达载体的构建
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 载体和菌株
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器
1.1.4 试剂的配制
1.1.4.1 琼脂糖凝胶电泳试剂配制
1.1.4.2 大肠杆菌转化用溶液
1.1.4.3 焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液的配制
1.1.4.4 感受态细胞制备
1.2 方法
1.2.1 鸡ST3GAL Ⅰ基因的克隆
1.2.1.1 鸡ST3GAL Ⅰ基因的引物设计与合成
1.2.1.2 鸡肠道组织总RNA的提取
1.2.1.3 cDNA第一链合成
1.2.1.4 鸡ST3GAL Ⅰ基因的PCR扩增
1.2.1.5 PCR产物的回收与纯化
1.2.1.6 重组克隆质粒的构建
1.2.1.7 重组质粒的鉴定
1.2.1.8 鸡ST3GAL Ⅰ基因生物信息学分析
1.2.2 pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ真核表达载体的构建
1.2.2.1 引物的设计及合成
1.2.2.2 鸡ST3GAL Ⅰ基因的扩增
1.2.2.3 PCR产物的纯化回收
1.2.2.4 PCR产物和pcDNA3.1(+)载体的酶切回收
1.2.2.5 目的基因与表达载体的连接
1.2.2.6 连接产物的转化
1.2.2.7 重组质粒的鉴定
2 结果与分析
2.1 鸡ST3GAL Ⅰ基因的RT-PCR扩增结果
2.2 重组克隆质粒pGEM-ST3GAL Ⅰ的鉴定
2.3 鸡ST3GAL Ⅰ基因测序结果及序列分析
2.4 不同物种ST3Gal Ⅰ基因的同源性分析
2.5 重组真核表达质粒pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ的鉴定
3 讨论
试验二 MDCK细胞转染条件的优化及pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ在MDCK细胞上的表达
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒和细胞
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器
1.1.4 所需溶液配制
1.2 方法
1.2.1 pcDNA3.1-EGFP重组质粒的构建
1.2.1.1 引物的设计及合成
1.2.1.2 EGFP基因的扩增
1.2.1.3 PCR产物的纯化回收
1.2.1.4 PCR产物和pcDNA3.1(+)载体的酶切回收
1.2.1.5 目的基因与表达载体的连接
1.2.1.6 连接产物的转化
1.2.1.7 重组表达质粒的鉴定
1.2.2 MDCK细胞转染条件优化
1.2.2.1 细胞准备
1.2.2.2 无内毒素质粒制备
1.2.2.3 pcDNA3.1-EGFP质粒转染MDCK细胞
1.2.2.4 质粒与脂质体比例对转染效率的影响
1.2.2.5 质粒用量对转染效率的影响
1.2.2.6 细胞密度对转染效率的影响
1.2.3 pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ真核表达载体在MDCK细胞的表达
1.2.4 RT-PCR检测ST3GALⅠ基因mRNA转录水平表达
1.2.4.1 内参基因合成
1.2.4.2 细胞总RNA的提取
1.2.4.3 RNA中DNA的消化
1.2.4.4 总RNA含量测定
1.2.4.5 cDNA的合成
1.2.4.6 ST3GALⅠ基因的扩增
1.2.4.7 内参GAPDH基因的扩增
2 结果与分析
2.1 pcDNA3.1-EGFP真核表达质粒的鉴定
2.1.1 重组质粒pcDNA3.1-EGFP质粒PCR鉴定
2.1.2 重组质粒pcDNA3.1-EGFP酶切鉴定
2.2 pcDNA3.1-EGFP质粒转染MDCK细胞条件优化
2.2.1 质粒与脂质体比例对转染效率的影响
2.2.2 质粒用量对转染效率的影响
2.2.3 细胞密度对转染效率的影响
2.3 RT-PCR检测转染MDCK细胞后ST3GAL Ⅰ基因mRNA转录水平表达
2.3.1 细胞总RNA完整性及纯度检测
2.3.2 RT-PCR检测ST3GAL基因mRNA转录水平表达
3 讨论
试验三 H9亚型禽流感病毒在过表达ST3GAL Ⅰ基因的MDCK细胞上的增殖情况
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 毒株
1.1.2 细胞与质粒
1.1.3 主要试剂
1.1.4 主要仪器
1.1.5 所需试剂配制
1.2 方法
1.2.1 H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上的增殖
1.2.2 H9亚型禽流感病毒HA试验
1.2.3 H9亚型禽流感病毒TCID50的测定
2 结果
2.1 转染组与未转染组CPE结果
2.2 HA结果
2.3 TCID50测定结果
3 讨论
全文总结
参考文献
英文摘要
附录
本文编号：3778175
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3778175.html
