猪轮状病毒NSP4蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位的鉴定

发布时间：2023-04-05 06:24

　　猪轮状病毒（PoRV），属呼肠孤病毒科轮状病毒属，是引起各种幼龄动物腹泻的主要病原之一。猪轮状病毒常与猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）混合感染，引起哺乳仔猪的严重腹泻，出现呕吐、脱水、高热，死亡率极高。轮状病毒几乎在所有的猪群中存在，且可以通过乳汁由母猪感染仔猪。该病广泛分布于世界各地，给全球养猪业造成严重经济损失。 轮状病毒基因组由11个节段双链RNA组成，编码12种蛋白质，其中包括结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7和非结构蛋白NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5。NSP4由病毒第十基因片段编码，是最先被描述的病毒肠毒素。它是一个多功能的蛋白。为了帮助RV在内质网中的成熟，NSP4在不引起病理变化的前提下，可以诱导新生小鼠的腹泻。NSP4融合蛋白的表达可以提高内源钙离子水平，感染的肠上皮细胞遭到破坏而导致吸收不良。它的内毒素活性也可能是引起腹泻的一种机制。另外，在RV感染病人体内存在NSP4特异性IgA和IgG血清转化，表明NSP4可以暴露于免疫细胞。 本研究通过RT-PCR的方法扩增了猪轮状病毒NSP4蛋白的基因，将其克隆...

【文章页数】：55 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 轮状病毒概述
        1.1.1 轮状病毒的形态结构
        1.1.2 轮状病毒的理化特性
        1.1.3 轮状病毒的基因组结构特点
        1.1.4 轮状病毒结构蛋白及功能
        1.1.5 轮状病毒非结构蛋白及功能
        1.1.6 流行病学
    1.2 轮状病毒抗原表位研究进展
    1.3 抗原表位研究方法
        1.3.1 T 细胞抗原表位研究方法
        1.3.2 B 细胞抗原表位研究方法
    1.4 研究目的和意义
第二章 轮状病毒 NSP4 蛋白的原核表达
    2.1 材料和方法
        2.1.1 病毒株、菌种、质粒
        2.1.2 主要试剂和设备
        2.1.3 限制性内切酶与引物
        2.1.4 RNA 提取
        2.1.5 蛋白原核表达载体的构建
        2.1.6 NSP4 蛋白的原核表达及 SDS-PAGE 检测
        2.1.7 NSP4 蛋白的纯化
        2.1.8 重组蛋白的 Western Blot 分析
    2.2 结果
        2.2.1 NSP4 基因的扩增
        2.2.2 重组质粒的酶切鉴定
        2.2.3 表达产物的 SDS-PAGE 分析
        2.2.4 蛋白的纯化
        2.2.5 重组蛋白的 Western Blot 分析
    2.3 讨论
第三章 轮状病毒 NSP4 蛋白单克隆抗体的制备
    3.1 材料和方法
        3.1.1 主要试剂
        3.1.2 细胞及实验动物
        3.1.3 主要仪器及设备
        3.1.4 MAb 的制备
        3.1.5 MAb 特性及杂交瘤细胞的鉴定
    3.2 结果
        3.2.1 间接 ELISA 检测方法的建立
        3.2.2 杂交瘤细胞株的建立
        3.2.3 抗体效价测定及 MAb 亚类鉴定
        3.2.4 Western blot 鉴定
        3.2.5 间接免疫荧光鉴定
    3.3 讨论
第四章 轮状病毒 NSP4 蛋白抗原表位的鉴定
    4.1 材料和方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 多肽的设计
        4.1.3 抗原表位的鉴定
        4.1.4 抗原表位的保守性及同源性分析
    4.2 结果
        4.2.1 蛋白表位预测及短肽设计序列
        4.2.2 ELISA 筛选抗原表位
        4.2.3 抗原表位同源性及保守性分析
    4.3 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：3782909