鸭瘟病毒UL22基因的多抗制备、细胞内定位及真核表达研究

发布时间：2023-04-07 23:51

　　本研究对DPV UL22基因进行了分子特性分析、克隆、原核表达、蛋白纯化、多克隆抗体的制备、细胞内的定位及真核表达研究,获如下结果：1.鸭瘟病毒UL22基因的生物信息学分析通过生物信息学分析工具对UL22基因核苷酸序列、编码蛋白gH及与其它疱疹病毒的同源性作了分析。结果表明UL22基因为2505bp,分子量92.5433kDa,编码834个氨基酸,有一条信号肽和两个跨膜区,还含有8个N-糖基化位点和52个潜在的磷酸化位点,抗原位点较多,gH蛋白的分子之间形成了三个二硫键。同源性分析表明gH蛋白在疱疹病毒中是非常保守的,且与马立克病毒属的MeHV-1.GaHV-2和GaHV-3 UL22基因的同源性最高。2.鸭瘟病毒截段基因的原核表达及抗体的制备根据生物信息学预测结果,去除掉gH蛋白的信号肽和跨膜区得到了截段形式的gHt基因,构建了原核表达重组质粒pET32c(+)-gHt,转化到宿主菌BL21后在37℃、0.2mmol/L IPTG及10h诱导条件下,得到gHt蛋白,该蛋白主要存在于包涵体。纯化的gHt蛋白免疫兔子制备的高免血清效价达到1：32,Western blot证实gHt蛋白可...

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略词及符号表
一、引言
    1 疱疹病毒UL22基因及其编码糖蛋白gH的研究进展
        1.1 疱疹病毒的基本特征
        1.2 UL22基因序列及其编码蛋白的结构特点
            1.2.1 UL22基因序列特点
            1.2.2 糖蛋白gH的特点
            1.2.3 糖蛋白gH的功能域
        1.3 疱疹病毒糖蛋白gH的功能
            1.3.1 介导病毒的入侵和细胞间的传播
            1.3.2 在膜融合过程中的作用
            1.3.3 抗原性
            1.3.4 抗病毒作用
        1.4 疱疹病毒糖蛋白gH与其它蛋白的相互作用
            1.4.1 糖蛋白gH和gL的相互作用
            1.4.2 糖蛋白gH与gE的相互作用
            1.4.3 第三蛋白与gH/gL复合体的相互作用
        1.5 展望
    2 选题目的及意义
二、实验研究
    1 实验材料
        1.1 基因序列
        1.2 毒株、菌种、载体及细胞
        1.3 主要试剂
        1.4 主要试剂的配制
        1.5 主要仪器
        1.6 实验动物
    2 实验方法
        2.1 DPV UL22基因序列及其编码蛋白的生物信息学分析
            2.1.1 DPV UL22基因的核苷酸序列分析
            2.1.2 DPV UL22基因编码蛋gH的生物信息学分析
            2.1.3 同源性分析
        2.2 DPV UL22基因的克隆表达、蛋白纯化及多抗制备
            2.2.1 DPV UL22基因的克隆
            2.2.2 UL22截段基因gHt重组原核表达质粒的构建
            2.2.3 重组蛋白gHt的诱导表达及条件优化
            2.2.4 重组蛋白gHt的纯化及鉴定
            2.2.5 兔抗DPV gHt多克隆抗体的制备
        2.3 DPV UL22编码蛋白gH在感染DEF中的定位分析
            2.3.1 间接免疫荧光检测DPV gH蛋白在DEF的定位
            2.3.2 gH蛋白在细胞内定位的动态分析
        2.4 DPV gH和gHt真核表达载体的构建及表达分析
            2.4.1 DPV UL22基因和UL22截段基因重组真核表达质粒的构建
            2.4.2 HEK293细胞的培养
            2.4.3 重组质粒pCMV-HA-gH和pCMV-HA-gHt转染HEK293细胞
            2.4.4 重组质粒的表达分析
    3 实验结果
        3.1 DPV UL22基因序列及其编码蛋白的生物信息学分析结果
            3.1.1 DPV UL22基因的核苷酸序列分析结果
            3.1.2 DPV UL22基因编码蛋白gH的生物信息学分析结果
            3.1.3 同源性分析结果
        3.2 DPV UL22基因的克隆表达、蛋白纯化及多抗制备结果
            3.2.1 DPV UL22基因及截段UL22基因的克隆与鉴定
            3.2.2 原核表达重组质粒pET32c(+)-gHt的构建与鉴定
            3.2.3 gHt的诱导表达及条件优化
            3.2.4 重组蛋白gHt的纯化与鉴定
            3.2.5 多抗的制备与鉴定
        3.3 DPV UL22编码蛋白gH在感染DEF中的定位分析
            3.3.1 特异性试验结果
            3.3.2 DPV gH蛋白在感染病毒的宿主细胞中的定位分析及动态检测
        3.4 DPV gH和gHt真核表达载体的构建及表达分析
            3.4.1 重组质粒pCMV-HA-gH和pCMV-HA-gHt的构建及鉴定
            3.4.2 重组质粒pCMV-HA-gH和pCMV-HA-gHt的表达分析
    4 分析讨论
        4.1 DPV UL22基因序列及其编码蛋白的生物信息学分析
        4.2 DPV UL22基因的克隆表达、蛋白纯化及多抗制备
            4.2.1 引物的设计
            4.2.2 重组质粒的构建
            4.2.3 蛋白的表达、纯化及多抗的制备
        4.3 DPV UL22编码蛋白gH在感染DEF中的定位分析
        4.4 DPV gH和gHt真核表达载体的构建及表达分析
三、结论
参考文献
致谢
作者简介及攻读硕士学位期间学术论文发表



本文编号：3785581