山羊耳尖成纤维细胞重编程为多能干细胞的研究

发布时间：2023-04-08 04:02

　　2006年,诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)被日本东京大学的Takahashi和Yamanaka发现,由于其与胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ES)存在相似的自我更新和分化潜能,且不涉及伦理问题。因此,在临床治疗等方面具有广阔的研究前景并迅速成为当前研究的热点。 本试验以山羊为材料分离山羊耳尖成纤维细胞(Goat ear fibroblast, GEF),并通过多顺反子慢病毒系统和可诱导慢病毒系统尝试重编程GEF为山羊iPS细胞,优化山羊iPS细胞的诱导方法。结果如下： 1.通过组织块贴壁法成功分离得到GEF,通过酶消化法分离C57/BL6小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast, MEF)。丝裂霉素C处理MEF和GEF,制备饲养层。 2.慢病毒载体与包装载体共转293t细胞,进行慢病毒包装,48h后,荧光显微镜下可见绿色荧光表达,收集慢病毒上清液并测定滴度。多顺反子慢病毒plentG-KOSM滴度为105～6TU/ml,用Millipore的100KD浓缩柱使其滴度达到...

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
英文缩略词表
第一章 文献综述
    1 iPS细胞系的制备方法
        1.1 转录因子的选择
            1.1.1 Oct4
            1.1.2 Sox2
            1.1.3 Klf4
            1.1.4 c-Myc
            1.1.5 Lin28
            1.1.6 Nanog
            1.1.7 hTert
            1.1.8 SV40大T抗原
        1.2 基因导入方式
        1.3 靶细胞的选择
        1.4 iPS细胞的培养条件
        1.5 iPS克隆的识别和鉴定
    2 iPS细胞的临床应用前景
    3 研究的目的和意义
第二章 材料与方法
    1 试验材料
        1.1 试验动物
        1.2 载体和菌株
        1.3 试剂及其配置
            1.3.1 主要试剂
            1.3.2 溶液的配制
        1.4 主要仪器和设备
    2 试验方法
        2.1 质粒获取
            2.1.1 质粒回收
            2.1.2 质粒转化
            2.1.3 质粒提取
            2.1.4 质粒双酶切鉴定
        2.2 细胞分离培养
            2.2.1 MEF分离培养
            2.2.2 GEF分离培养
        2.3 慢病毒包装
            2.3.1 准备包装细胞
            2.3.2 转染
            2.3.3 收集病毒
        2.4 病毒滴度测定
        2.5 饲养层细胞制备
        2.6 山羊iPS细胞的建立
            2.6.1 慢病毒感染GEF
            2.6.2 iPS克隆挑选
            2.6.3 iPS克隆的传代扩增
            2.6.4 山羊iPS细胞冻存
            2.6.5 山羊iPS细胞复苏
        2.7 山羊iPS细胞生物学特性检测
            2.7.1 形态学鉴定
            2.7.2 碱性磷酸酶染色
            2.7.3 细胞内ES细胞标志性基因表达的检测
            2.7.4 免疫荧光染色
            2.7.5 山羊iPS表观遗传特征分析
            2.7.6 体外分化能力检测
            2.7.7 畸胎瘤形成与体内分化能力测定
第三章 结果与分析
    1 慢病毒载体鉴定
        1.1 质粒提取
        1.2 酶切鉴定
    2 GEF和MEF分离培养及饲养层的制作
        2.1 GEF分离培养
        2.2 MEF分离培养
    3 慢病毒包装
        3.1 plentG-KOSM
        3.2 可诱导慢病毒系统
    4 山羊iPS细胞的获得
        4.1 plentG-KOSM
        4.2 可诱导慢病毒系统
    5 AP染色
    6 ES细胞标志性基因表达的检测
    7 免疫荧光染色
    8 表观遗传状态鉴定
    9 体外分化
    10 畸胎瘤实验
第四章 讨论
    1 慢病毒载体的选择
    2 GEF和MEF的分离培养
    3 慢病毒包装
    4 山羊iPS细胞的获得
    5 ES细胞标志性物
    6 表观遗传状态鉴定
    7 体内外分化能力
第五章 小结
在读期间发表论文
参考文献
致谢



本文编号：3785965