猪链球菌2型毒素-抗毒素系统yefM-yoeB的鉴定和功能研究
发布时间：2023-04-09 23:29
近年来,由于毒素-抗毒素(Toxin-antitoxin,TA)系统在细菌和古生菌基因组中大量的广泛存在,然对其生理功能的认识却十分有限,因此引起了越来越多的关注。TA系统最初发现于大肠杆菌低拷贝质粒中,利用一种称为是“分裂后杀伤机制”或“成瘾模块”的机制发挥质粒的稳定性功能。TA系统在影响细菌自身的生长调控、生物被膜的形成、毒力或其他不利条件的应激反应中发挥重要作用。这些模块已经在大肠杆菌和其他各种细菌中被鉴定,但其功能尚需进行深入研究。此外,TA系统存在于猪链球菌(Streptococcus suis)这一重要人兽共患病原菌基因组中,却鲜有报道。尽管目前关于猪链球菌致病性的研究有很多,但对其发病机制的认识仍然非常有限。因此,在本研究中,我们主要开展了猪链球菌2型yefM-yoeB TA系统的鉴定和功能研究,来探讨TA系统与猪链球菌致病性的关系。具体研究内容如下:1.猪链球菌2型毒素-抗毒素系统yefM-yoeB的鉴定生物信息学分析显示猪链球菌2型YefM和YoeB与大肠杆菌、肺炎链球菌的具有极高的同源性,且yefM-yoeB染色体位点存在于猪链球菌的大多数血清型菌株的基因组中。过量...
【文章页数】：113 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 文献综述
1.1 猪链球菌概述
1.1.1 猪链球菌的流行病学
1.1.2 猪链球菌病的治疗和防控
1.1.3 猪链球菌毒力因子相关的致病性研究进展
1.2 毒素-抗毒素系统
1.2.1 毒素-抗毒素系统具有重要的生物学功能
1.2.2 毒素-抗毒素系统影响细菌致病性
1.2.3 毒素-抗毒素系统调控生物膜形成
1.2.4 毒素-抗毒素系统调控持留菌形成
1.2.5 毒素-抗毒素系统调控细菌的适应性
1.2.6 毒素-抗毒素系统的发展前景
1.3 Ⅱ型毒素-抗毒素系统
1.3.1 Ⅱ型毒素-抗毒素系统的种类
1.3.2 Ⅱ型毒素-抗毒素系统的研究进展
1.3.3 猪链球菌Ⅱ型毒素-抗毒素系统
2 研究目的与意义
3 实验材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 菌株、质粒和培养条件
3.1.2 实验相关试剂
3.1.3 本研究所用引物
3.1.4 实验动物和细胞
3.2 实验方法
3.2.1 猪链球菌2 型基因组DNA的提取
3.2.2 猪链球菌2型RNA的提取、RT-PCR和 qRT-PCR
3.2.3 重组质粒的构建
3.2.4 大肠杆菌生长曲线的测定
3.2.5 YefM-YoeB蛋白的克隆、表达和纯化
3.2.6 小鼠血清抗体的制备和Western blot检测
3.2.7 抗毒素或毒素-抗毒素复合物对TA操纵子的自动调节
3.2.8 猪链球菌2 型基因缺失突变株的构建
3.2.9 互补菌株C?yefM-yoeB的构建
3.2.10 突变株、野生株和互补菌株的生物学特性研究
3.2.11小鼠感染实验
3.2.12 猪全血杀菌实验
3.2.13 毒素-抗毒素定点突变
3.2.14 在不同条件下生长曲线的测定
3.2.15 BALB/c小鼠感染实验
3.2.16 细胞实验
3.2.17 统计分析
4 结果与分析
4.1 猪链球菌2型YEFM-YOEB II型毒素-抗毒素系统的鉴定
4.1.1 生物信息学分析
4.1.2 YoeB、YefM、YefM-YoeB对大肠杆菌的生长影响
4.1.3 猪链球菌YoeB的毒性作用
4.1.4 引入猪链球菌yefM-yoeB影响大肠杆菌生长
4.1.5 毒素抗毒素形成复合物
4.1.6 毒素抗毒素系统的自我调控
4.2 猪链球菌2 型缺失毒素-抗毒素系统YEFM-YOEB的影响
4.2.1 自杀性重组载体的构建和鉴定
4.2.2 猪链球菌2型yoeB基因缺失突变株的鉴定
4.2.3 猪链球菌2型yefM-yoeB基因缺失突变株和互补菌株的筛选与鉴定
4.2.4 突变株和野生株体外生长特性的比较
4.2.5 突变株和野生株的溶血活性比较
4.2.6 突变株和野生株的耐药性检测
4.2.7 猪链球菌2 型缺失yefM-yoeB对小鼠的致病力的影响
4.2.8 缺失yefM-yoeB影响猪链球菌2 型在猪全血中的增殖情况
4.3 毒素-抗毒素蛋白相互作用的关键位点
4.3.1 YefM-YoeB蛋白结构解析
4.3.2 YoeB活性位点的验证
4.3.3 YefM点突变影响大肠杆菌的生长
4.3.4 YefM点突变影响猪链球菌2 型的生长
4.3.5 YefM点突变影响猪链球菌2 型的应激反应
4.3.6 YefM点突变影响猪链球菌2 型在小鼠体内的存活
4.3.7 YefM点突变后影响细胞毒性
5 讨论
5.1 课题的选择
5.2 猪链球菌2 型毒素YoeB可以被同源YefMSsu和异源YefMSpn中和,不被YefMEco中和
5.3 猪链球菌2 型毒素-抗毒素yefM-yoeB影响大肠杆菌生长
5.4 YefM-YoeB蛋白的表达问题及猪链球菌2 型缺失抗毒素基因致死原因
5.5 猪链球菌2 型毒素-抗毒素系统yefM-yoeB对抗生素耐药性的影响
5.6 小鼠模型评价猪链球菌2型毒素-抗毒素系统缺失的致病性问题
5.7 YefM-YoeB晶体解析及相互作用的关键位点影响猪链球菌2 型的氧化应激能力和致病性
6 结论与展望
参考文献
附录
补充材料
个人简历
致谢
本文编号：3787925
【文章页数】：113 页
【学位级别】：博士
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摘要
Abstract
缩略语表
1 文献综述
1.1 猪链球菌概述
1.1.1 猪链球菌的流行病学
1.1.2 猪链球菌病的治疗和防控
1.1.3 猪链球菌毒力因子相关的致病性研究进展
1.2 毒素-抗毒素系统
1.2.1 毒素-抗毒素系统具有重要的生物学功能
1.2.2 毒素-抗毒素系统影响细菌致病性
1.2.3 毒素-抗毒素系统调控生物膜形成
1.2.4 毒素-抗毒素系统调控持留菌形成
1.2.5 毒素-抗毒素系统调控细菌的适应性
1.2.6 毒素-抗毒素系统的发展前景
1.3 Ⅱ型毒素-抗毒素系统
1.3.1 Ⅱ型毒素-抗毒素系统的种类
1.3.2 Ⅱ型毒素-抗毒素系统的研究进展
1.3.3 猪链球菌Ⅱ型毒素-抗毒素系统
2 研究目的与意义
3 实验材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 菌株、质粒和培养条件
3.1.2 实验相关试剂
3.1.3 本研究所用引物
3.1.4 实验动物和细胞
3.2 实验方法
3.2.1 猪链球菌2 型基因组DNA的提取
3.2.2 猪链球菌2型RNA的提取、RT-PCR和 qRT-PCR
3.2.3 重组质粒的构建
3.2.4 大肠杆菌生长曲线的测定
3.2.5 YefM-YoeB蛋白的克隆、表达和纯化
3.2.6 小鼠血清抗体的制备和Western blot检测
3.2.7 抗毒素或毒素-抗毒素复合物对TA操纵子的自动调节
3.2.8 猪链球菌2 型基因缺失突变株的构建
3.2.9 互补菌株C?yefM-yoeB的构建
3.2.10 突变株、野生株和互补菌株的生物学特性研究
3.2.11小鼠感染实验
3.2.12 猪全血杀菌实验
3.2.13 毒素-抗毒素定点突变
3.2.14 在不同条件下生长曲线的测定
3.2.15 BALB/c小鼠感染实验
3.2.16 细胞实验
3.2.17 统计分析
4 结果与分析
4.1 猪链球菌2型YEFM-YOEB II型毒素-抗毒素系统的鉴定
4.1.1 生物信息学分析
4.1.2 YoeB、YefM、YefM-YoeB对大肠杆菌的生长影响
4.1.3 猪链球菌YoeB的毒性作用
4.1.4 引入猪链球菌yefM-yoeB影响大肠杆菌生长
4.1.5 毒素抗毒素形成复合物
4.1.6 毒素抗毒素系统的自我调控
4.2 猪链球菌2 型缺失毒素-抗毒素系统YEFM-YOEB的影响
4.2.1 自杀性重组载体的构建和鉴定
4.2.2 猪链球菌2型yoeB基因缺失突变株的鉴定
4.2.3 猪链球菌2型yefM-yoeB基因缺失突变株和互补菌株的筛选与鉴定
4.2.4 突变株和野生株体外生长特性的比较
4.2.5 突变株和野生株的溶血活性比较
4.2.6 突变株和野生株的耐药性检测
4.2.7 猪链球菌2 型缺失yefM-yoeB对小鼠的致病力的影响
4.2.8 缺失yefM-yoeB影响猪链球菌2 型在猪全血中的增殖情况
4.3 毒素-抗毒素蛋白相互作用的关键位点
4.3.1 YefM-YoeB蛋白结构解析
4.3.2 YoeB活性位点的验证
4.3.3 YefM点突变影响大肠杆菌的生长
4.3.4 YefM点突变影响猪链球菌2 型的生长
4.3.5 YefM点突变影响猪链球菌2 型的应激反应
4.3.6 YefM点突变影响猪链球菌2 型在小鼠体内的存活
4.3.7 YefM点突变后影响细胞毒性
5 讨论
5.1 课题的选择
5.2 猪链球菌2 型毒素YoeB可以被同源YefMSsu和异源YefMSpn中和,不被YefMEco中和
5.3 猪链球菌2 型毒素-抗毒素yefM-yoeB影响大肠杆菌生长
5.4 YefM-YoeB蛋白的表达问题及猪链球菌2 型缺失抗毒素基因致死原因
5.5 猪链球菌2 型毒素-抗毒素系统yefM-yoeB对抗生素耐药性的影响
5.6 小鼠模型评价猪链球菌2型毒素-抗毒素系统缺失的致病性问题
5.7 YefM-YoeB晶体解析及相互作用的关键位点影响猪链球菌2 型的氧化应激能力和致病性
6 结论与展望
参考文献
附录
补充材料
个人简历
致谢
本文编号：3787925
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