SPCS1影响乙型脑炎病毒复制的分子机制研究
发布时间：2023-04-10 02:03
乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)属黄病毒科黄病毒属,是一种由蚊传播的人兽共患病病原。黄病毒属成员还包括WNV、ZIKV、DENV和YFV等可致人和动物感染发病的病原。JEV感染可以引起人和动物发病,人与马感染可引起脑炎,重者可致死亡;母猪感染可致流产与死胎;多数动物呈隐性感染。JEV主要在东南亚地区流行,但存在全球性扩散风险。目前还没有针对JEV的特异性治疗方法。为寻找新的潜在性药物靶位点,需要加深认识病毒复制过程以及与宿主间相互作用机制。研究表明SPCS1是JEV等黄病毒在细胞内复制所需的宿主因子之一,在病毒多聚蛋白剪切加工中发挥重要作用。为了进一步研究SPCS1分子对JEV复制影响的分子机制。本研究运用多种技术手段分析了SPCS1分子对JEV病毒复制过程中各阶段的影响,研究了SPCS1参与JEV病毒复制的分子机制。本研究首先利用siRNA干扰宿主SPCS1基因,验证了SPCS1分子对JEV复制的正调控作用。再使用CRISPR/Cas9技术敲除SPCS1基因,构建SPCS1基因缺失的HEK-293细胞系(SPCS1 KO HEK-293细...
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 引言
1.1 JEV分子生物学特性
1.1.1 JEV物理特性及基因组结构
1.1.2 JEV结构蛋白功能与特点
1.1.3 JEV非结构蛋白的功能与特点
1.2 JEV复制机制研究进展
1.2.1 病毒的入侵
1.2.2 病毒基因组的翻译与复制
1.2.3 病毒粒子的组装与释放
1.2.4 JEV的致病机制
1.3 JEV与宿主相互作用研究进展
1.3.1 JEV蛋白与宿主蛋白的相互作用对病毒复制的影响
1.3.2 病毒和宿主因子相互作用的研究方法
1.4 信号肽酶复合体
1.5 研究的目的和意义
第二章 SPCS1对JEV复制的影响
2.1 实验材料
2.1.1 主要材料、试剂
2.1.2 实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 SIRNA设计合成与转染
2.2.2 SIRNA转染与病毒感染
2.2.3 间接免疫荧光试验(IFA)
2.2.4 高内涵细胞筛选系统成像与分析
2.2.5 细胞增殖活性检测
2.2.6 SPCS1缺失对JEV感染率的影响
2.2.7 SPCS1缺失对JEV感染致细胞病变影响的观察
2.2.8 JEVE蛋白与NS1蛋白的WESTERNBLOT检测
2.2.9 病毒效价测定
2.2.10 SPCS1功能补偿实验
2.3 实验结果
2.3.1 SIRNA干扰SPCS1后降低JEV复制
2.3.2 JEV对SPCS1KO细胞感染率降低
2.3.3 JEV对SPCS1KO细胞不造成细胞病变
2.3.4 SPCS1缺失降低病毒蛋白表达
2.3.5 SPCS1缺失显著降低JEV复制水平
2.3.6 补偿SPCS1提高SPCS1KO细胞中JEV复制水平
2.4 讨论
第三章 SPCS1缺失对JEV复制环节影响的研究
3.1 实验材料
3.1.1 主要材料、试剂
3.1.2 实验仪器
3.2 实验方法
3.2.1 稳定表达JEVC-PRM-E细胞系的构建
3.2.2 JEV复制缺陷性病毒的构建和单轮感染能力检测
3.2.3 RRPS对HEK-293与SPCS1KOHEK-293细胞入侵性实验
3.2.4 反转录荧光定量PCR实验
3.2.5 WB检测JEVE蛋白、PRM与NS1蛋白
3.2.6 电子显微镜观察JEV的子代病毒
3.2.7 报告型病毒组装系统分析病毒的组装
3.3 实验结果
3.3.1 IFA鉴定BJEV-CME细胞系JEVE的表达
3.3.2 RRPS单轮感染能力检测
3.3.3 SPCS1不影响JEV入侵
3.3.4 SPCS1不影响JEV基因组的复制
3.3.5 WB鉴定SPCS1不影响JEV蛋白的翻译
3.3.6 电子显微镜观察SPCS1影响子代病毒颗粒的组装
3.3.7 SPCS1缺失影响病毒组装
3.4 讨论
第四章 JEVNS2B与SPCS1的相互作用
4.1 实验材料
4.1.1 主要材料、试剂
4.1.2 实验仪器
4.2 实验方法
4.2.1 双分子荧光互补实验(BIFC)
4.2.2 免疫共沉淀
4.3 实验结果
4.3.1 SPCS1与NS2B在细胞中的相互作用
4.3.2 NS2B的缺失突变与定点突变
4.3.3 NS2B的跨膜区与SPCS1具有相互作用
4.3.4 与SPCS1相互作用的NS2B关键位点鉴定
4.3.5 SPCS1的跨膜区与NS2B具有相互作用
4.3.6 BIFC分析JEVNS2B截短突变体与NS2A相互作用区域
4.3.7 NS2B与SPCS1、NS2A相互作用模型
4.4 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3788128
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 引言
1.1 JEV分子生物学特性
1.1.1 JEV物理特性及基因组结构
1.1.2 JEV结构蛋白功能与特点
1.1.3 JEV非结构蛋白的功能与特点
1.2 JEV复制机制研究进展
1.2.1 病毒的入侵
1.2.2 病毒基因组的翻译与复制
1.2.3 病毒粒子的组装与释放
1.2.4 JEV的致病机制
1.3 JEV与宿主相互作用研究进展
1.3.1 JEV蛋白与宿主蛋白的相互作用对病毒复制的影响
1.3.2 病毒和宿主因子相互作用的研究方法
1.4 信号肽酶复合体
1.5 研究的目的和意义
第二章 SPCS1对JEV复制的影响
2.1 实验材料
2.1.1 主要材料、试剂
2.1.2 实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 SIRNA设计合成与转染
2.2.2 SIRNA转染与病毒感染
2.2.3 间接免疫荧光试验(IFA)
2.2.4 高内涵细胞筛选系统成像与分析
2.2.5 细胞增殖活性检测
2.2.6 SPCS1缺失对JEV感染率的影响
2.2.7 SPCS1缺失对JEV感染致细胞病变影响的观察
2.2.8 JEVE蛋白与NS1蛋白的WESTERNBLOT检测
2.2.9 病毒效价测定
2.2.10 SPCS1功能补偿实验
2.3 实验结果
2.3.1 SIRNA干扰SPCS1后降低JEV复制
2.3.2 JEV对SPCS1KO细胞感染率降低
2.3.3 JEV对SPCS1KO细胞不造成细胞病变
2.3.4 SPCS1缺失降低病毒蛋白表达
2.3.5 SPCS1缺失显著降低JEV复制水平
2.3.6 补偿SPCS1提高SPCS1KO细胞中JEV复制水平
2.4 讨论
第三章 SPCS1缺失对JEV复制环节影响的研究
3.1 实验材料
3.1.1 主要材料、试剂
3.1.2 实验仪器
3.2 实验方法
3.2.1 稳定表达JEVC-PRM-E细胞系的构建
3.2.2 JEV复制缺陷性病毒的构建和单轮感染能力检测
3.2.3 RRPS对HEK-293与SPCS1KOHEK-293细胞入侵性实验
3.2.4 反转录荧光定量PCR实验
3.2.5 WB检测JEVE蛋白、PRM与NS1蛋白
3.2.6 电子显微镜观察JEV的子代病毒
3.2.7 报告型病毒组装系统分析病毒的组装
3.3 实验结果
3.3.1 IFA鉴定BJEV-CME细胞系JEVE的表达
3.3.2 RRPS单轮感染能力检测
3.3.3 SPCS1不影响JEV入侵
3.3.4 SPCS1不影响JEV基因组的复制
3.3.5 WB鉴定SPCS1不影响JEV蛋白的翻译
3.3.6 电子显微镜观察SPCS1影响子代病毒颗粒的组装
3.3.7 SPCS1缺失影响病毒组装
3.4 讨论
第四章 JEVNS2B与SPCS1的相互作用
4.1 实验材料
4.1.1 主要材料、试剂
4.1.2 实验仪器
4.2 实验方法
4.2.1 双分子荧光互补实验(BIFC)
4.2.2 免疫共沉淀
4.3 实验结果
4.3.1 SPCS1与NS2B在细胞中的相互作用
4.3.2 NS2B的缺失突变与定点突变
4.3.3 NS2B的跨膜区与SPCS1具有相互作用
4.3.4 与SPCS1相互作用的NS2B关键位点鉴定
4.3.5 SPCS1的跨膜区与NS2B具有相互作用
4.3.6 BIFC分析JEVNS2B截短突变体与NS2A相互作用区域
4.3.7 NS2B与SPCS1、NS2A相互作用模型
4.4 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3788128
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