miR-652调控猪PYY基因以及PYY基因5’侧翼序列甲基化的研究
发布时间：2023-04-10 20:26
采食量直接决定动物能够从环境中获得多少营养物质,它是评价动物营养物质需求和能量代谢的基础,而生理因素是影响动物采食量的最根本的因素。研究表明,在下丘脑食欲调控网络中有许多促进食欲和抑制食欲的调控因子,PYY就是其中之一。PYY在食欲和机体肥胖上面有重要的调控作用,动物减少采食后pYY的释放增加,显示食欲增强,并与肥胖呈负相关,对PYY的调控可能是机体控制食欲的重要途径。因此,本研究从PYY基因的表观遗传调控入手,电子克隆猪PYY基因,找寻能够引起PYY基因3’UTR潜在miRNA结合位点发生改变的SNP,并加以验证,同时探讨了PYY基因5’侧翼序列的甲基化状态,初步解析了miR-652与PYY之间的作用关系以及PYY甲基化状态,为PYY调控猪采食量进一步提供了理论基础,并为利用PYY进行采食量控制的具体应用提供素材。取得的结果如下： 1. q-PCR组织表达谱结果显示：PYY基因在大白和梅山猪胃、十二指肠中的表达量明显比在脑、心等组织中要高,并且梅山猪各组织中PYY的表达量均高于大白猪；梅山30日龄、75日龄和275日龄在十二指肠和胃中PYY基因呈现逐渐升高的表达趋势,并且十二指肠中的...
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 文献综述
1 PYY功能以及研究进展
1.1 多肽家族中的PYY
1.2 PYY基因定位
1.3 PYY在机体内的功能
1.4 PYY偏爱的受体
2 SNP概述
2.1 SNP的分类
2.2 SNP的检测方法
3 MIRNA的功能和研究进展
3.1 miRNA的研究方法
3.2 miRNA的生物合成过程
3.3 miRNA的作用机制
4 DNA甲基化功能与机制研究进展
4.1 DNA甲基化的生物学功能
4.2 DNA甲基化检测方法
4.3 甲基转移模式
5 本试验的目的和意义
第二章 材料与方法
1 试验材料
1.1 细胞样品
1.2 组织样本
1.2.1 提取全基因组DNA样品
1.2.2 提取总RNA组织样
1.3 载体和菌株
1.4 主要仪器与设备
1.5 主要的试剂与药品
1.6 主要试剂的配置
1.7 主要的分子生物学软件和网站
2 试验方法
2.1 血液、组织DNA提取
2.2 组织、细胞总RNA提取
2.3 cDNA的制备
2.4 PYY基因表达谱分析
2.5 序列扩增寻找SNP
2.5.1 引物设计
2.5.2 PCR扩增体系、条件
2.5.3 琼脂糖凝胶电泳、胶回收
2.5.4 连接
2.5.5 连接产物的转化
2.5.6 阳性克隆的筛选及测序
2.5.7 测序结果分析和对比
2.6 猪PYY基因3’UTR序列的克隆和重组表达质粒构建
2.6.1 引物设计
2.6.2 双酶切
2.6.3 连接
2.6.4 重组质粒的原核表达鉴定
2.6.5 质粒的抽提及酶切鉴定
2.6.6 细胞培养
2.6.7 瞬时转染
2.6.8 荧光素酶相对活性测定与分析
2.7 构建突变型载体
2.7.1 引物设计
2.7.2 PCR扩增
2.8 Western Blot验证
2.8.1 蛋白浓度测定
2.8.2 SDS-PAGE凝胶电泳
2.8.3 免疫反应
2.8.4 ECL化学发光检测
2.9 DNA甲基化
2.9.1 CpG岛预测
2.9.2 甲基化分析模板DNA的处理
2.9.3 PCR扩增及克隆、测序
第三章 结果与分析
1 猪PYY基因组织表达谱分析
1.1 总RNA的提取和质量控制
1.2 cDNA的合成和质量检测
1.3 梅山、大白猪PYY组织表达谱
1.4 猪PYY基因在梅山猪30日龄、75日龄和275日龄十二指肠和胃中的表达分析
1.5 猪PYY基因在大白猪3日龄、30日龄和120日龄十二指肠和胃中的表达分析
2 大白和梅山猪PYY基因3’UTR扩增和SNP寻找
2.1 猪PYY基因3’UTR序列的克隆
2.2 大白和梅山猪PYY基因3’UTR序列对比
3 MIR-652对靶基因调控研究
3.1 与靶基因绑定的microRNA预测
3.2 猪PYY基因3’UTR序列的克隆及酶切回收
3.3 荧光素酶报告载体的构建以及检测结果
3.3.1 野生型荧光素酶报告载体的构建
3.3.2 miR-652 mimic转染PK细胞活性分析
3.4 突变型荧光素酶报告载体构建以及检测结果
3.4.1 突变载体构建
3.4.2 双荧光素酶报告基因检测结果
3.5 转染后PK细胞中PYY基因定量分析
3.6 Westernblot检测PYY蛋白水平的表达
4 猪PYY基因5’侧翼序列甲基化的研究
4.1 猪PYY基因5’侧翼序列CpG岛预测
4.2 含有CpG岛片段的扩增
4.3 PYY基因5’侧翼CpG岛甲基化分析
第四章 讨论
4.1 猪PYY基因组织表达谱分析
4.2 猪PYY基因3’UTR中的SNP
4.3 MIR-652对PYY基因的调控
4.4 猪PYY基因5’侧翼甲基化分析
第五章 小结
5.1 本试验主要结论
5.2 本研究的特色与创新点
5.3 本研究的不足以及下一步的工作建议
参考文献
致谢
本文编号：3788676
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 文献综述
1 PYY功能以及研究进展
1.1 多肽家族中的PYY
1.2 PYY基因定位
1.3 PYY在机体内的功能
1.4 PYY偏爱的受体
2 SNP概述
2.1 SNP的分类
2.2 SNP的检测方法
3 MIRNA的功能和研究进展
3.1 miRNA的研究方法
3.2 miRNA的生物合成过程
3.3 miRNA的作用机制
4 DNA甲基化功能与机制研究进展
4.1 DNA甲基化的生物学功能
4.2 DNA甲基化检测方法
4.3 甲基转移模式
5 本试验的目的和意义
第二章 材料与方法
1 试验材料
1.1 细胞样品
1.2 组织样本
1.2.1 提取全基因组DNA样品
1.2.2 提取总RNA组织样
1.3 载体和菌株
1.4 主要仪器与设备
1.5 主要的试剂与药品
1.6 主要试剂的配置
1.7 主要的分子生物学软件和网站
2 试验方法
2.1 血液、组织DNA提取
2.2 组织、细胞总RNA提取
2.3 cDNA的制备
2.4 PYY基因表达谱分析
2.5 序列扩增寻找SNP
2.5.1 引物设计
2.5.2 PCR扩增体系、条件
2.5.3 琼脂糖凝胶电泳、胶回收
2.5.4 连接
2.5.5 连接产物的转化
2.5.6 阳性克隆的筛选及测序
2.5.7 测序结果分析和对比
2.6 猪PYY基因3’UTR序列的克隆和重组表达质粒构建
2.6.1 引物设计
2.6.2 双酶切
2.6.3 连接
2.6.4 重组质粒的原核表达鉴定
2.6.5 质粒的抽提及酶切鉴定
2.6.6 细胞培养
2.6.7 瞬时转染
2.6.8 荧光素酶相对活性测定与分析
2.7 构建突变型载体
2.7.1 引物设计
2.7.2 PCR扩增
2.8 Western Blot验证
2.8.1 蛋白浓度测定
2.8.2 SDS-PAGE凝胶电泳
2.8.3 免疫反应
2.8.4 ECL化学发光检测
2.9 DNA甲基化
2.9.1 CpG岛预测
2.9.2 甲基化分析模板DNA的处理
2.9.3 PCR扩增及克隆、测序
第三章 结果与分析
1 猪PYY基因组织表达谱分析
1.1 总RNA的提取和质量控制
1.2 cDNA的合成和质量检测
1.3 梅山、大白猪PYY组织表达谱
1.4 猪PYY基因在梅山猪30日龄、75日龄和275日龄十二指肠和胃中的表达分析
1.5 猪PYY基因在大白猪3日龄、30日龄和120日龄十二指肠和胃中的表达分析
2 大白和梅山猪PYY基因3’UTR扩增和SNP寻找
2.1 猪PYY基因3’UTR序列的克隆
2.2 大白和梅山猪PYY基因3’UTR序列对比
3 MIR-652对靶基因调控研究
3.1 与靶基因绑定的microRNA预测
3.2 猪PYY基因3’UTR序列的克隆及酶切回收
3.3 荧光素酶报告载体的构建以及检测结果
3.3.1 野生型荧光素酶报告载体的构建
3.3.2 miR-652 mimic转染PK细胞活性分析
3.4 突变型荧光素酶报告载体构建以及检测结果
3.4.1 突变载体构建
3.4.2 双荧光素酶报告基因检测结果
3.5 转染后PK细胞中PYY基因定量分析
3.6 Westernblot检测PYY蛋白水平的表达
4 猪PYY基因5’侧翼序列甲基化的研究
4.1 猪PYY基因5’侧翼序列CpG岛预测
4.2 含有CpG岛片段的扩增
4.3 PYY基因5’侧翼CpG岛甲基化分析
第四章 讨论
4.1 猪PYY基因组织表达谱分析
4.2 猪PYY基因3’UTR中的SNP
4.3 MIR-652对PYY基因的调控
4.4 猪PYY基因5’侧翼甲基化分析
第五章 小结
5.1 本试验主要结论
5.2 本研究的特色与创新点
5.3 本研究的不足以及下一步的工作建议
参考文献
致谢
本文编号：3788676
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