利用CRISPR/Cas9系统构建可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系

发布时间：2023-04-12 03:12

　　【目的】将Tet-on系统与CRISPR/Cas9系统相结合建立诱导敲除猪Sohlh1基因的细胞系。【方法】分离培养猪胎儿成纤维细胞(PFF),进行慢病毒载体PCW-eSpCas9(1.1)侵染并通过1μg/mL嘌呤霉素筛选及强力霉素(Dox)诱导;改造pLV-sgRNA载体,进行293FT细胞转染验证;构建含Sohlh1基因目标靶点的pLV-sgRNA-2AGFP特异性载体,进行慢病毒包装检测;利用包装病毒侵染稳转PCW-eSpCas9(1.1)的PFF细胞,3μg/mL灭稻瘟菌素进行筛选,随后添加Dox诱导进行表达分析和敲除效率检测。【结果】建立了受Dox调控可诱导eSpCas9(1.1)蛋白表达的PFF细胞系,不添加Dox,eSpCas9(1.1)蛋白不表达;293FT细胞表达绿色荧光,表明pLV-sgRNA-2A-GFP载体改造成功。3、4、6号Sohlh1基因靶点具有敲除活性,利用最优的2个靶点构建了pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,荧光表达显示载体慢病毒包装成功。构建稳转PCW-eSpCas9(1.1)和pLVsgRNA-2A-GFP的PFF,经Dox诱导72 h...

【文章页数】：8 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 供试材料
        1.1.1 试验动物组织
        1.1.2 质粒和细胞株
        1.1.3 主要试剂
    1.2 方法
        1.2.1 PFF细胞的获取
        1.2.2 PCW-eSpCas9(1.1)慢病毒载体侵染PFF细胞及检测
        1.2.3 pLV-sgRNA载体的改造及验证
        1.2.4 猪Sohlh1基因的扩增及靶位点预测
        1.2.5 pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体的构建及慢病毒包装
        1.2.6 筛选细胞系阳性比例鉴定
2 结果与分析
    2.1 转PCW-eSpCas9(1.1)基因细胞系的检测
    2.2 pLV-sgRNA载体的改造结果
    2.3 猪Sohlh1基因测序及靶位点的选择
    2.4 pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体的构建及慢病毒包装检测
    2.5 慢病毒侵染PFF细胞及阳性细胞筛选结果
3 讨论与结论



本文编号：3790311