鸭坦布苏病毒HN株基因组序列分析及抗E蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

发布时间：2023-04-15 02:01

　　鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus, DTMUV),是黄病毒科黄病毒属的单股正链RNA病毒,其基因组编码三个结构蛋白(衣壳蛋白C、外膜蛋白PrM/M与囊膜蛋白E)与七个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B与NS5)。DTMUV感染鸭群后主要引起鸭产蛋骤然大幅下降,该病传播迅速,给我国带来了严重的经济损失。DTMUV囊膜(Envelope, E)蛋白是病毒粒子的主要结构蛋白,含有多个抗原决定簇,能诱导产生中和抗体,引起宿主产生保护性的免疫应答,同时E蛋白也在DTMUV复制过程中起一定的作用。 本研究对一株鸭坦布苏病毒的全基因组序列进行测定,进行系统进化关系分析,并对病原的基因组结构进行分析,包括多聚蛋白的剪切位点、半胱氨酸的分布、潜在的糖基化位点以及3’UTR的二级结构；然后以DTMUV HN株为基础毒株,通过RT-PCR扩增E基因,用原核表达载体pET-30a(+)构建重组表达质粒,命名为pET-E,通过pET-E表达的E蛋白经由切胶的方法进行纯化；利用纯化的DTMUV HN株E蛋白免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,制备免疫小鼠的脾细胞,与骨...

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硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表 摘要 Abstract 英文縮略表 第一章 引言
1.1 鸭坦布苏病毒病概述
1.2 鸭坦布苏病毒病的病原学特征
    1.2.1 鸭坦布苏病毒的形态结构
    1.2.2 鸭坦布苏病毒的理化特性
    1.2.3 鸭坦布苏病毒的培养特性
    1.2.4 鸭坦布苏病毒的基因组及其编码的蛋白质
1.3 鸭坦布苏病毒病的流行病学特征
1.4 鸭坦布苏病毒病的诊断
    1.4.1 临床症状
    1.4.2 病理变化
    1.4.3 病毒的分离与鉴定
    1.4.4 鸭坦布苏病毒病的病原学诊断
    1.4.5 鸭坦布苏病毒病的血清学诊断
1.5 鸭坦布苏病毒病的防治
1.6 研究目的与意义 第二章 鸭坦布苏病毒HN株基因组序列分析
2.1 材料
    2.1.1 病毒、菌株、载体及实验动物
    2.1.2 主要试剂
    2.1.3 实验所需仪器
2.2 方法
    2.2.1 病毒来源
    2.2.2 RT-PCR和测序
    2.2.3 系统进化分析
    2.2.4 多聚蛋白剪切位点预测
    2.2.5 3'UTR与环状序列的二级结构
2.3 结果
    2.3.1 HN株全基因组序列特征
    2.3.2 3'UTR的二级结构
    2.3.3 剪切位点、半胱氨酸残基分布及潜在糖基化位点
    2.3.4 HN株与其它黄病毒的系统进化树分析
2.4 讨论 第三章 DTMUV E蛋白的原核表达及鉴定
3.1 材料
    3.1.1 病毒、载体、菌株及血清
    3.1.2 主要试剂
    3.1.3 实验所需仪器
    3.1.4 引物设计
3.2 方法
    3.2.1 DTMUV RNA的提取及cDNA的获得
    3.2.2 DTMUV E基因的PCR扩增
    3.2.3 PCR产物的胶回收
    3.2.4 目的基因克隆与鉴定
    3.2.5 原核表达重组载体的构建及鉴定
    3.2.6 E蛋白的原核表达及SDS-PAGE分析
    3.2.7 E蛋白的纯化
    3.2.8 E蛋白的免疫原性鉴定
3.3 结果
    3.3.1 E基因扩增
    3.3.2 pMD18-T-E的酶切鉴定
    3.3.3 重组质粒pET-E的酶切鉴定
    3.3.4 蛋白的SDS-PAGE分析
    3.3.5 E蛋白的Western-blot鉴定
3.4 讨论 第四章 抗DTMUV E蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
4.1 材料
    4.1.1 病毒株、细胞及实验动物
    4.1.2 主要试剂及耗材
    4.1.3 仪器设备
4.2 方法
    4.2.1 动物免疫
    4.2.2 间接ELISA筛选方法的建立
    4.2.3 小鼠饲养层细胞的制备
    4.2.4 细胞的融合
    4.2.5 阳性细胞株的筛选
    4.2.6 单克隆抗体的鉴定
4.3 结果
    4.3.1 筛选阳性杂交瘤细胞方法的建立
    4.3.2 Dot-ELISA鉴定结果
    4.3.3 Western blot鉴定结果
    4.3.4 IFA鉴定结果
4.4 讨论 第五章 全文结论 参考文献 致谢 作者简历



本文编号：3790892