伪狂犬病毒的分离鉴定及gI/gE双基因缺失株的构建

发布时间：2023-04-19 01:30

　　伪狂犬病(Pesudorabies virus.PRV)又称奇痒症,是由伪狂犬病毒引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)、脑脊髓炎和神经系统症状为主要特征的高度接触性传染病。猪是其天然宿主、储存宿主和传染源,可垂直传播,也可通过消化道、相互接触而传播。目前在全世界广泛流行,给全世界养猪业带来巨大的经济损失。2011年前后,我国多地区接种过Bartha K61基因缺失疫苗的猪场暴发了疑似PR疫情,造成新生仔猪死亡率高,母猪流产、产死胎等,给各地养猪业带来了巨大的经济损失。本试验从四川某接种过疫苗后,出现大规模新生仔猪死亡疑似PR感染的猪场仔猪脑组织样品中成功分离到一株PRV野毒株,将其命名为PRV-XJ株。将其接种于BHK-21细胞,30h后细胞出现聚集、收缩、变圆、拉网、折光性增强、成片脱落等典型的细胞病变,将其进行5轮蚀斑纯化后,进行了一系列的生物学鉴定和部分生物学特性分析。分离到的PRV-XJ株在BHK-21细胞上生长滴度可达10^7.67TCID₅₀/mL,能被PRV阳性血清中和,其中和效价为1：128,将其接种小鼠,很快小鼠出现...

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【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
主要缩略词
第一章 文献综述
    1 病原学
        1.1 PRV的结构特征
        1.2 PRV的理化特性和培养特性
        1.3 PRV分子生物学特性
            1.3.1 PRV基因结构
            1.3.2 非必需糖蛋白及功能
            1.3.3 必需糖蛋白及功能
        1.4 PRV的复制
        1.5 PRV的致病机制
    2 PRV的流行及诊断
        2.1 PRV在全球范围的流行
        2.2 PRV在我国的流行
        2.3 临床症状及病理变化
        2.4 PRV的检测
            2.4.1 病毒的分离
            2.4.2 血清学诊断
    3 疫苗防治
        3.1 弱毒疫苗
        3.2 灭活苗
        3.3 DNA疫苗
        3.4 重组疫苗
        3.5 亚单位疫苗
        3.6 基因缺失苗
            3.6.1 单基因缺失苗
            3.6.2 双基因缺失苗
            3.6.3 多基因缺失苗
        3.7 gE/gI基因缺失在疫苗防治的应用前景
    4 研究目的及意义
第二章 PRV野毒株的分离鉴定及部分生物学特性分析
    1 材料
        1.1 病料
        1.2 细胞、主要试剂
        1.3 阳性血清和试验小鼠
        1.4 主要培养基及其配制
        1.5 主要仪器
    2 方法
        2.1 用于检测的PCR引物
        2.2 病毒核酸提取及PCR鉴定
        2.3 病毒的分离
        2.4 病毒的蚀斑纯化
        2.5 外源病毒的检测
        2.6 病毒TCID₅₀的测定
        2.7 病毒的血清中和试验
        2.8 小鼠LD₅₀的测定
        2.9 PRV部分基因的分段扩增及序列分析
            2.9.1 用于扩增PRV XJ株部分基因片段的引物设计
            2.9.2 PRV XJ株DNA的分段扩增
            2.9.3 克隆片段的胶回收
            2.9.4 回收片段的连接转化
            2.9.5 重组质粒的鉴定及扩大培养
            2.9.6 扩增目的片段的基因测序与序列拼接
            2.9.7 PRV-XJ株部分基因组的序列分析
    3 结果
        3.1 病料检测
        3.2 PRV病毒的分离
        3.3 病毒的空斑形态
        3.4 外源病毒的检测结果
        3.5 PRV-XJ株TCID₅₀的测定
        3.6 PRV-XJ株的中和试验
        3.7 小鼠感染试验
        3.8 PRV-XJ株gE、gC、gD及gB基因扩增结果
        3.9 阳性质粒的鉴定
        3.10 PRV-XJ株gE基因核苷酸和氨基酸序列分析
            3.10.1 gE基因核苷酸和氨基酸序列分析
            3.10.2 gE基因氨基酸进化树分析
        3.11 PRV-XJ株gC基因核苷酸和氨基酸序列分析
            3.11.1 gC基因核苷酸和氨基酸序列分析
            3.11.2 gC基因氨基酸进化树分析
        3.12 PRV-XJ株gD基因核苷酸和氨基酸序列分析
            3.12.1 gD基因核苷酸和氨基酸序列分析
            3.12.2 gD基因氨基酸进化树分析
        3.13 PRV-XJ株gB基因核苷酸和氨基酸序列分析
            3.13.1 gB基因核苷酸和氨基酸序列分析
            3.13.2 gB基因氨基酸进化树分析
    4 讨论
        4.1 分离鉴定
        4.2 序列分析
    5 小结
第三章 PRV-gI/gE双基因缺失突变株的构建和免疫效力研究
    1 材料
        1.1 细胞、病毒、质粒和试剂
        1.2 实验动物
        1.3 主要仪器
    2 方法
        2.1 质粒DNA的小量制备及酶切鉴定
        2.2 质粒的大量制备
        2.3 PRV-XJ株病毒DNA的提取
        2.4 转染细胞的准备
        2.5 体外转染哺乳动物细胞脂质体转化法(LiPofection Reagent)
        2.6 基因缺失病毒rPRVXJ-de1gI/gE-EGFP的纯化
        2.7 基因缺失病毒rPRVXJ-de1gI/gE-EGFP的PCR鉴定与IFA
        2.8 基因缺失病毒rPRVXJ-de1gI/gE-EGFP的一步生长曲线测定
        2.9 免疫及攻毒
        2.10 酶联免疫试验
        2.11 免疫及攻毒后的排毒检测
        2.12 数据处理
    3 结果
        3.1 质粒pPI-2.EGFP的鉴定
        3.2 PRV的同源重组和rPRVXJ-de1gI/gE-EGFP的纯化
        3.3 基因缺失病毒rPRVXJ-de1gI/gE-EGFP的鉴定
        3.4 病毒生长曲线的测定
        3.5 中和抗体水平检测
        3.6 免疫及攻毒后临床变化
        3.7 免疫及攻毒后排毒检测
    4 讨论
    5 小结
全文总结
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文



本文编号：3793441