通城猪和大白猪胎儿期背最长肌miRNA测序及其与转录组和蛋白质组的整合分析

发布时间：2023-04-19 01:51

　　通城猪(TC)和大白猪(YK)是两个具有独特肌肉特点的猪品种。在本研究中,首先,通过Solexa测序研究了通城猪和大白猪胎儿期40天、55天、63天、70和90天五个发育阶段背最长肌中miRNA的表达情况,筛选两猪种中调节肌肉发育的差异表达miRNA。其次,联合同一批样品检测得到的转录组、蛋白质组数据,对miRNA进行深度分析,并对挖掘到的差异表达miRNA-差异表达蛋白进行靶基因验证。最后,对miR-499-5p在肌肉细胞中的功能进行研究。主要研究结果如下:1.共对比注释得到320个猪已知miRNA、64个其他哺乳动物已知miRNA以及224个预测的新miRNA。主成分分析和层次聚类分析表明,猪品种间miRNA的表达差异小于发育阶段miRNA的表达差异。通城猪不同发育阶段中差异表达miRNA合计共有57个,大白猪合计共有45个,随肌肉发育进程表达水平逐步下降的差异表达miRNA占大多数。通城猪、大白猪相同发育时间点的差异表达miRNA分别有23、30、12、6、30个,主要与蛋白修饰、蛋白转运和代谢过程相关。miR-499-5p表达量高,同时是不同发育阶段差异表达miRNA,且是唯一...

【文章页数】：150 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
缩略表(Abbreviation)
第一章 前言
    1.通城猪与大白猪
    2.猪骨骼肌发育
        2.1 .猪骨骼肌发育的时间节点
        2.2 .猪骨骼肌肌纤维类型
    3.骨骼肌发育中的肌动蛋白重塑
        3.1 .骨骼肌发育的主要调控因子
        3.2 .骨骼肌发育中调控因子的时序表达
        3.3 .肌细胞融合需要重构肌动蛋白
        3.4 .ADF家族在肌动蛋白重构中发挥重要作用
    4.骨骼肌发育相关miRNA
        4.1 .miRNA的调控机制
        4.2 .骨骼肌发育中的miRNA
        4.3 .miR-499-5p促进慢肌纤维形成
    5.猪肌肉miRNA组学及关联分析研究进展
        5.1 .猪肌肉miRNA组学研究进展
        5.2 .猪肌肉联合多组学分析miRNA的研究进展
        5.3 .其他物种的多组学关联分析研究
    6.目的与意义
第二章 猪miRNA文库构建及高通量测序分析
    1.前言
    2.试验材料
        2.1 .试验动物
        2.2 .主要仪器和设备
        2.3 .主要试剂
        2.4 .常用试剂配制
        2.5 .生物信息学分析
        2.6 .生物技术服务
    3.试验方法
        3.1 .RNA提取与质量检测
            3.1.1 .RNA提取
            3.1.2 .RNA质量检测
        3.2 .建立文库及测序
        3.3 .测序结果注释
            3.3.1 .测序数据过滤
            3.3.2 .比对与注释
            3.3.3 .miRNA表达量的计算
        3.4 .聚类分析
            3.4.1 .主成分分析
            3.4.2 .热图聚类分析
        3.5 .功能富集分析
            3.5.1 .靶基因预测
            3.5.2 .GO功能富集分析
            3.5.3 .KEGG通路富集分析
        3.6 .miRNA时序性表达分析
        3.7 .差异分析
        3.8 .实时荧光定量PCR
            3.8.1 .RNA反转录
            3.8.2 .引物设计及退火温度的确定
            3.8.3 .实时荧光定量
    4.结果与分析
        4.1 .原始数据
            4.1.1 .文库的建立
            4.1.2 .测序原始数据
        4.2 .miRNA特征分析
            4.2.1 .长度分布
            4.2.2 .基因组定位
            4.2.3 .注释分类
        4.3 .miRNA分类及靶基因预测
            4.3.1 .miRNA分类
            4.3.2 .miRNA靶基因预测
        4.4 .miRNA表达量及高表达miRNA的功能富集分析
        4.5 .聚类分析
            4.5.1 .PCA聚类
            4.5.2 .热图聚类
        4.6 .miRNA时序性表达分析及功能注释
        4.7 .差异表达miRNA及功能注释
            4.7.1 .不同发育阶段差异表达miRNA分析
            4.7.2 .品种间差异表达miRNA分析
        4.8 .测序数据的实时荧光定量PCR验证
    5.讨论
第三章 miRNA组、转录组和蛋白质组的整合分析及验证
    1.前言
    2.试验材料
        2.1 .载体、菌株、细胞
        2.2 .主要仪器和设备
        2.3 .主要试剂耗材
        2.4 .常用试剂配制
        2.5 .数据库与分析软件
        2.6 .生物技术服务
    3.试验方法
        3.1 .miRNA与转录组关联分析
            3.1.1 .筛选差异差异miRNA-差异表达靶基因对
        3.2 .网络互作分析及绘图
        3.3 .转录组与蛋白质组关联分析
        3.4 .功能富集分析
        3.5 .miRNA与蛋白质组关联分析
        3.6 .靶基因3’UTR双荧光素酶报告载体的构建
            3.6.1 .引物设计
            3.6.2 .T 载体质粒构建
            3.6.3 .双荧光素酶报告载体的构建
            3.6.4 .突变型双荧光素酶报告载体的构建
        3.7 .细胞培养
        3.8 .细胞转染
        3.9 .双荧光素酶活性的测定
    4.结果与分析
        4.1 .miRNA与转录组关联分析
            4.1.1 .不同发育阶段miRNA与转录组关联分析
            4.1.2 .不同品种miRNA与转录组关联分析
        4.2 .转录组与蛋白质组关联分析
        4.3 .miRNA与蛋白质组关联分析
        4.4 .三对猪miRNA与靶基因验证
        4.5 .三对小鼠miRNA与靶基因验证
    5.讨论
第四章 miR-499-5p的功能验证
    1.前言
    2.试验材料
        2.1 .细胞
        2.2 .主要仪器和设备
        2.3 .主要试剂耗材
        2.4 .常用试剂配制
        2.5 .数据库与分析软件
        2.6 .生物技术服务
    3.试验方法
        3.1 .细胞培养及转染
        3.2 .RNA提取与质量检测
        3.3 .实时荧光定量PCR
            3.3.1 .茎环引物法RNA反转录
            3.3.2 .茎环引物设计及退火温度的确定
            3.3.3 .实时荧光定量
        3.4 .免疫荧光检测
        3.5 .细胞周期检测
        3.6 .细胞迁移检测
        3.7 .细胞凋亡检测
    4.结果与分析
        4.1 .miR-499-5p转录后水平调控DSTN
            4.1.1 .miR-499-5p不影响DSTN的 mRNA水平
            4.1.2 .miR-499-5p抑制DSTN蛋白表达
        4.2 .miR-499-5p促进细胞迁移
        4.3 .miR-499-5p提高G0、G1 期细胞比例
        4.4 .分化的启动不能缺少miR-499-5p
        4.5 .miR-499-5p表达水平异常促进细胞凋亡
    5.讨论
第五章 总结
    1.本研究的主要结论与创新点
    2.本研究的不足之处与后续研究建议
参考文献
在读期间发表论文情况
致谢



本文编号：3793474