利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除奶山羊胎儿成纤维细胞SCD1基因

发布时间：2023-04-19 03:25

　　【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除奶山羊胎儿成纤维细胞(GFFs)中硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)基因,旨在为奶山羊敲入外源性基因奠定理论基础以及构建动物模型提供生物材料.【方法】根据"20N+NGG"原则在SCD1第4外显子和第6外显子分别设计6个靶向SCD1基因sgRNA(F1、F2、F3、S1、S2、S3),构建PX330-eGFP-sgRNA敲除载体,通过脂质体转染到GFFs中,PCR扩增阳性细胞SCD1外显子4和外显子6的核苷酸序列,连接到pEASY-Blunt载体上,测序评估不同sgRNA的敲除效率;分别在第4外显子和第6外显子选择敲除效率高的sgRNA共同转染GFFs,经流式分选获得敲除SCD1基因的GFFs.【结果】设计的6个sgRNA均能够连入PX330-eGFP载体中,单克隆菌测序试验表明sgRNA F2、sgRNA F3、sgRNA S1和sgRNA S2具有敲除作用,其敲除效率分别为41.67%、30.77%、6.67%和28.57%;实时荧光定量PCR检测结果表明sgRNA-F2-S2与sgRNA-F3-S2转染组均能显著降低阳性细胞中SC...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 试验材料
    1.2 试验方法
        1.2.1 引物设计
        1.2.2 sgRNA的合成及程序性退火
        1.2.3 敲除载体的构建
        1.2.4 细胞的转染及切割效率的检测
        1.2.5 PX330-eGFP-sgRNA共转染细胞
        1.2.6 Quantitative RT-PCR检测
        1.2.7 Western Blot检测
2 结果与分析
    2.1 敲除载体的构建
    2.2 奶山羊胎儿成纤维细胞的转染结果
    2.3 分选阳性细胞及其PCR检测
    2.4 不同靶位点sgRNA敲除效率的筛选
    2.5 敲除SCD1基因GFFs的制备
3 讨论
4 结论



本文编号：3793622