Fat-1表达载体构建及转Fat-1基因萨福克羊成纤维细胞系的建立研究

发布时间：2023-04-19 20:22

　　目的：ω-3PUFAs对于维持生命有机体的正常发育和生长，防治各种疾病都有至关重要的作用，由于缺乏能够将ω-6PUFAs转化成ω-3PUFAs的脱氢酶基因，人体内的ω-6/ω-3PUFAs达不到1:1理想的平衡，所以每天必须摄入一定量的ω-3PUFAs，来保证有机体正常的功能和自身稳定。目前富含ω-3PUFAs食物主要是深海鱼类，来源范围很窄，导致人体内ω-6PUFAs过多而ω-3PUFAs严重不足，对婴幼儿智力发育、心脑血管疾病和癌症的预防起不了积极作用。因此从家畜繁殖与育种的角度出发，制备能够表达ω-3PUFAs的脱氢酶基因Fat-1的新品种绵羊，从而培育出富含ω-3PUFAs高品质羊肉。 方法：1.Fat-1表达载体构建及转基因细胞系建立 采用组织块附植法分离得到了18月龄萨福克公羊成纤维细胞系；通过PCR扩增得到了人泛素启动子UbB序列，对秀丽隐杆线虫Fat-1基因密码子根据绵羊对同义密码子使用偏好性进行优化，然后由公司合成获得oFat-1基因序列；双酶切法从pcDNA3.1中获得GBHpolyA序列，将上述3段序列共同插入pCMV-DsRed2-1载体的多克隆位点（MCS），...

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
英文缩写对照
文献综述
    1 Fat - 1 基因
        1.1 Fat -1 基因来源及结构
        1.2 Fat -1 基因研究现状
    2 不饱和脂肪酸脱氢酶的研究进展
    3 多不饱和脂肪酸
        3.1 多不和脂肪酸概述
        3.2 多不饱和脂肪酸研究进展
        3.3 ω- 3PUFAs 的生理作用
            3.3.1 临床作用
            3.3.2 对血管疾病作用
            3.3.3 ω- 3PUFAs 与抗癌作用
        3.4 ω- 3PUFAs 的测定方法研究进展
    4 泛素启动子研究
        4.1 泛素启动子的结构
        4.2 泛素启动子的作用机制
        4.3 泛素启动子的研究现状
    5 本课题研究的目的和意义
试验研究
    试验1 萨福克羊成纤维细胞体外培养
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 试验材料
                1.1.1 细胞来源
                1.1.2 主要试剂及培养液
                1.1.3 主要仪器设备
            1.2 试验方法
                1.2.1 萨福克羊成纤维细胞原代培养
                1.2.2 细胞分离培养及传代
                1.2.3 细胞的冻存
                1.2.4 细胞的复苏
                1.2.5 细胞对 G418 敏感度检测
        2 试验结果与分析
            2.1 成纤维细胞体外生长状况及特征观察
            2.3 G418 敏感度检测
        3 讨论
        4 小结
    试验2 UbB 启动子的功能验证
        摘要
        1 材料与方法
            1.1 试验材料
                1.1.1 细胞来源
                1.1.2 质粒的和感受态细胞
                1.1.3 主要试验试剂和溶液配制
                1.1.4 主要试验仪器
            1.2 试验方法
                1.2.1 引物设计
                1.2.2 启动子 UbB 的克隆
                    1.2.2.1 UbB 序列的 PCR 扩增
                    1.2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测
                    1.2.2.3 PC R 产物回收及连接 T-easy Vector
                    1.2.2.4 连接产物转化 DH - 5α
                    1.2.2.5 阳性克隆的筛选和初步鉴定
                1.2.3 UbB - pEGFP- c1 表达载体构建
                    1.2.3.1 重组质粒提取
                    1.2.3.2 双酶切、回收纯化及连接
                1.2.4 转染细胞和比较启动效率
        2 试验结果
            2.1 启动子 PCR 扩增
            2.2 重组质粒 UbB- pEGFP - c1 酶切鉴定
            2.3 转染细胞和比较启动效率
        3 讨论
        4 小结
    试验3 含 Fat - 1 基因表达载体的构建
        摘要
        1 试验材料与方法
            1.1 试验材料
                1.1.1 质粒和宿主菌
                1.1.2 主要试剂、溶液和仪器设备
            1.2 试验方法
                1.2.1 Fat - 1 基因密码子优化
                1.2.2 表达载体构建
                1.2.3 重组质粒的鉴定
                    1.2.3.1 PCR 扩增鉴定
                    1.2.3.2 酶切鉴定
                    1.2.3.3 测序鉴定
        2 试验结果
            2.1 密码子使用频率分析
            2.2 重组质粒合成与鉴定
            2.3 重组表达载体分子水平鉴定
            2.4 测序鉴定
        3 讨论
        4 小结
    试验4 Fat -1 基因在绵羊成纤维细胞中的表达
        摘要
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 细胞来源
                1.1.2 主要试剂及培养液
                1.1.3 主要仪器设备
            1.2 方法
                1.2.1 细胞准备
                1.2.2 脂质体转染
                1.2.3 细胞筛选
                1.2.4 纯化培养
                1.2.5 阳性细胞 DNA 水平鉴定
                1.2.6 阳性细胞 RNA 水平鉴定
                    1.2.6.1 阳性细胞 RNA 提取
                    1.2.6.2 反转录合成 cDNA (Reverse Transcription ，RT )
                    1.2.6.3 RT - PCR 扩增
                1.2.7 脂肪酸含量测定
                1.2.8 细胞染色体数目分析
        2 试验结果
            2.1 绵羊成纤维细胞的转染和筛选
            2.2 转基因细胞的鉴定
            2.3 脂肪酸含量变化检测
            2.4 染色体数目形态分析
        3 讨论
        4 小结
    试验5 转 Fat - 1 基因克隆绵羊的制备
        摘要
        1 试验材料与方法
            1.1 试验材料
                1.1.1 供体与受体来源
                1.1.2 试验试剂和药品
                1.1.3 试验仪器
            1.2 试验方法
                1.2.1 绵羊卵母细胞采集与体外成熟
                1.2.2 受体细胞的处理
                1.2.3 供体细胞的准备
                1.2.4 重构胚的制备
                    1.2.4.1 去核
                    1.2.4.2 移核
                    1.2.4.3 融合
                    1.2.4.4 融合胚的激活与发育培养
                    1.2.4.5 胚胎移植
                1.2.6 B 超检查、产羔及接产
                1.2.7 转 oFat-1 基因克隆羊初步 PCR 鉴定
                1.2.8 转基因绵羊成纤维细胞染色体数目分析
        2 试验结果
            2.1 成熟卵母细胞的收获
            2.2 核移植制备重构胚
            2.3 胚胎移植、B 超妊娠确诊与产羔
            2.4 克隆羊 PCR 初步鉴定
            2.5 染色体数目分析
        3 讨论
        4 小结
全文结论及创新
参考文献
附录
致谢
作者简介



本文编号：3794156