锌指核酸酶介导的奶山羊BLG基因敲除

发布时间：2023-04-25 04:21

　　p-乳球蛋白(BLG)是牛奶中的主要蛋白,要占到乳清蛋白总量的一半以上,被认为是导致乳过敏症的过敏原。降低羊奶中的β-乳球蛋白含量,能使羊乳在食品工业中得到更广泛的应用。而经典的生化手段在去除羊乳中的p-乳球蛋白过程繁杂、副产物多、成本较高,不易推广使用。因此利用分子育种手段生产BLG基因敲除奶山羊将为解决这一问题带来希望。 锌指核酸酶(ZFN)技术可以针对设计好的基因组靶序列高效、安全地进行修饰,生产转基因动物。模块拼装是一个快速,便捷,开放源码的锌指核酸酶合成方法。然而,这阻碍了多步建设,低效率的编辑和脱靶裂解生物技术。BLG是唯一一个被成功修饰的反刍动物基因,打靶的ZFNs由Sigma-Aldrich公司合成。 在本研究中,利用重叠PCR法优化建立了一套快速、便捷、高效的模块拼装锌指核酸酶构建法。利用这套优化体系,设计并合成了6对靶向山羊BLG基因第一外显子的锌指核酸酶组合。在设计锌指核酸酶的同时,我们还利用分子建模的方法对设计的锌指核酸酶蛋白结构以及靶片段结合效果进行预测并进行评估,预测结果与实验结果进行比较,以期提供一种预测人工构建蛋白功能以及合成预筛选的方法。 构建好的锌指...

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

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目录
摘要
ABSTRACT
缩略词
引言
第一章 文献综述
    1 山羊β-乳球蛋白与BLG基因研究概况
        1.1 β-乳球蛋白的结构
        1.2 β乳球蛋白的致敏性,对其传统的理化消除方法及局限性
        1.3 BLG基因的结构
        1.4 分子育种方法消除β-乳球蛋白影响的尝试
    2 锌指核酸酶研究概况
        2.1 锌指结构的特点
        2.2 锌指核酸酶的结构与作用原理
        2.3 锌指核酸酶的构建过程
        2.4 锌指核酸酶在动物基因组修饰中的应用
    3 本研究的目的与意义
第二章 锌指核酸酶的构建与模块拼装法的技术优化
    1 实验材料
        1.1 菌株与质粒
        1.2 实验试剂
        1.3 主要仪器及实验器械
        1.4 网络资源及软件
    2 实验方法
        2.1 重叠PCR构建锌指模块
        2.2 锌指模块与非特异性核酸酶的拼装
        2.3 转化
        2.4 阳性克隆的鉴定
        2.5 质粒提取
        2.6 锌指核酸酶的分子建模模拟
    3 实验结果
        3.1 锌指模块的设计
        3.2 重叠PCR构建锌指模块
        3.3 锌指核酸酶的构建
        3.4 锌指核酸酶的分子建模与打靶效率预测
    4 讨论
第三章 锌指核酸酶在山羊成纤维细胞中敲除BLG基因的研究
    1 实验材料
        1.1 细胞及其来源
        1.2 网络资源及软件
        1.3 主要试剂
        1.4 仪器设备
    2 实验方法
        2.1 山羊胎儿皮肤成纤维细胞的培养
        2.2 锌指核酸酶质粒的转染
        2.3 转染效率统计
            2.3.1 DAPI染色与细胞观察
            2.3.2 细胞计数
        2.4 细胞基因组提取
        2.5 靶目标片段的扩增
        2.6 靶片段的突变检测
        2.7 锌指核酸酶的体外转录
    3 结果
        3.1 山羊胎儿成纤维细胞的培养
        3.2 细胞转染效率的优化以及锌指核酸酶转染山羊成纤维细胞
        3.3 锌指核酸酶介导的细胞突变检测
        3.4 锌指核酸酶的体外转录
    4 讨论
全文结论
参考文献
致谢
硕士期间发表的论文



本文编号：3800693