水牛7sk/U6启动子克

发布时间：2023-04-29 23:34

　　水牛具有适应性强、耐高温高湿、抗病力强、耐粗饲、容易饲养、使用年限长等优点,非常适合我国南方农村饲养,是我国南方极具开发价值的大家畜。口蹄疫是一种由口蹄疫病毒引起的以侵害偶蹄动物为主的急性、热性、高度接触性传染病,被世界动物卫生组织列为A类动物传染病。为应用水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子进行基因沉默研究,探讨应用RNAi沉默水牛口蹄疫病毒的可行性,本研究对水牛的7SK和U6启动子进行了克隆与活性分析,并应用其构建了多启动子串联RNAi抗口蹄疫病毒转基因小鼠模型,取得了如下的研究结果： 1、水牛7SK和U6启动子克隆与功能分析。参考牛的基因组序列,设计特异性扩增引物,成功克隆了长430bp和357bp的水牛7SK (Genbank序列号：JN417658)和U6启动子(Genbank序列号：JN417659)。为对比不同物种polⅢ启动子的活性,本研究还克隆了人、猪和牛的7SK和U6启动子。克隆的启动子与针对EGFP的短发卡RNA (shRNA)双链DNA片段(shEGFP)相连接,成功构建8个EGFP沉默表达载体(pbu7SK-shEGFP、 pbuU6-shEGFP、ph7SK-shEGF...

【文章页数】：135 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 RNAI技术的机制与应用
        1.1.1 RNA干扰现象发现
        1.1.2 RNAi技术的基本分子机制
        1.1.3 RNAi应用
    1.2 RNA聚合酶Ⅲ启动子的结构和应用
        1.2.1 RNA聚合酶Ⅲ启动子的起源
        1.2.2 RNA聚合酶Ⅲ启动子的结构
        1.2.3 RNA聚合酶Ⅲ启动子的可修饰性
        1.2.4 各物种RNA聚合酶Ⅲ启动子的克隆与鉴定
    1.3 RNAI技术抗病毒原理和应用
        1.3.1 RNAi技术抗病毒基本原理
        1.3.2 RNAi技术抗病毒应用
    1.4 口蹄疫的概述
        1.4.1 口蹄疫的发生和危害
        1.4.2 流行病学特点及临床诊断
        1.4.3 防治手段
        1.4.4 口蹄疫病毒基本结构
        1.4.5 口蹄疫病毒的致病机制
    1.5 动物转基因技术的研究进展和意义
        1.5.1 动物转基因技术的发展和应用
        1.5.2 动物转基因技术的应用
    1.6 研究目的及意义
第二章 水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子的克隆及鉴定
    摘要
    前言
    2.1 材料与试剂
    2.2 主要试验仪器
    2.3 试验方法
        2.3.1 全基因组DNA的抽提
        2.3.2 水牛启动子扩增及测序
        2.3.3 降落PCR
        2.3.4 RNAi表达载体的构建
        2.3.5 细胞培养及转染
        2.3.6 总RNA的抽提
        2.3.7 shEGFP表达量的茎-环RT-PCR对分析
        2.3.8 细胞表达EGFP的流式细胞仪的分析
        2.3.9 细胞表达EGFP的荧光实时定量PCR分析
    2.4 结果
        2.4.1 水牛7SK、U6启动子的克隆
        2.4.2 7SK和U6启动子表达shRNA载体的构建
        2.4.3 shEGFP表达量的实时定量PCR检测
        2.4.4 启动子在细胞中引导表达shRNA的效果
        2.4.5 EGFP表达的荧光实时定量PCR结果
    2.5 讨论
    2.6 结论
第三章 多SHRNA串联表达抗口蹄疫转基因载体构建与功能性检测
    摘要
    前言
    3.1 材料与试剂
    3.2 主要试验仪器
    3.3 试验方法
        3.3.1 抗口蹄疫shRNA选择和合成
        3.3.2 多shRNA串联抗口蹄疫表达载体的构建
        3.3.3 多个shRNA串联抗口蹄疫表达载体的慢病毒包装
        3.3.4 慢病毒载体的滴度测定
        3.3.5 转基因BHK-LV细胞制备
        3.3.6 shRNA表达量的实时定量PCR测定
        3.3.7 FMDV在转基因细胞BHK-LV中的复制曲线绘制
        3.3.8 抗口蹄疫慢病毒载体的乳鼠FMDV抗性试验
    3.4 结果
        3.4.1 选择和设计的抗口蹄疫shRNA序列
        3.4.2 构建得到的多个shRNA串联抗口蹄疫慢病毒表达载体和制备的转基因细胞
        3.4.3 FMDV在转基因细胞内的复制情况
        3.4.4 慢病毒LV-3shRNA处理乳鼠的抗FMDV能力
    3.5 讨论
    3.6 结论
第四章 抗口蹄疫RNAI转基因小鼠模型构建和抗病毒水平检测
    摘要
    前言
    4.1 材料与试剂
    4.2 主要试验仪器
    4.3 试验方法
        4.3.1 转基因用目的DNA制备
        4.3.2 转基因小鼠制备
        4.3.3 鼠尾基因组DNA提取
        4.3.4 PCR检测目的片段整合
        4.3.5 转基因小鼠选择、传代、遗传稳定性及健康状况鉴定
        4.3.6 转基因小鼠Southern Blotting检测
        4.3.7 激光共聚焦显微镜观察转基因小鼠各组织荧光表达
        4.3.8 茎-环RT-PCR法检测转基因小鼠中shRNA表达
        4.3.9 FMDV在抗口蹄疫转基因小鼠体内的接毒试验
        4.3.10 接种72h后各组织病毒量测定
    4.4 结果
        4.4.1 载体目的片段DNA的序列准备
        4.4.2 通过显微注射制备得到的转基因小鼠
        4.4.3 F0代转基因小鼠的外源基因整合情况
        4.4.4 转基因小鼠的遗传稳定性
        4.4.5 转基因小鼠的southern blotting检测结果
        4.4.6 激光共聚焦显微镜下转基因小鼠各组织EGFP表达情况
        4.4.7 抗口蹄疫shRNA在转基因小鼠组织内的表达
        4.4.8 FMDV在抗口蹄疫转基因小鼠体内的抑制情况
        4.4.9 接种后72h各组织病毒抑制情况
    4.5 讨论
    4.6 结论
第五章 结论
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表论文及专利情况



本文编号：3805969