猪流行性腹泻病毒分子流行病学调查及间接ELISA抗体检测方法的建立

发布时间：2023-05-14 02:45

　　猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是猪的一种高度接触性传染病。1978年该病病原猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)得到了首次鉴定。自2010年下半年以来,该病在我国的流行强度不断扩大,还伴有哺乳仔猪高死亡率等特点,给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。目前,国内外还没有建立一种标准化的,能在基层推广使用的PEDV鉴别检测方法。对国内流行毒株进行进一步的流行病学调查,并建立一种快速,准确的鉴别诊断方法是了解我国PED流行状况,更好的防控该病的前提,具有重要的实践意义。本研究具体内容如下： 1猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与流行病学调查 针对PEDV的保守基因M建立了RT-PCR检测方法,并证实其具有较高的敏感性和特异性。用建立的RT-PCR检测方法对猪群中的PEDV流行情况进行了调查,2011年3月至2012年12月间从9个省市共24个规模化猪场采集的113份腹泻病料的检测结果显示,有20个猪场70份样品为PEDV阳性,猪场阳性率达到83.33%,样品阳性率为61.95%,说明P...

【文章页数】：84 页

【学位级别】：硕士

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目录
摘要
ABSTRACT
第一篇 文献综述
    1 PED简介
    2 PEDV概述
        2.1 PEDV粒子结构
        2.2 PEDV理化与培养特性
        2.3 PEDV生物学分类地位
    3 PED流行特点和流行情况
    4 PED发病机理
    5 PED诊断技术
    6 PED的防治
    参考文献
第二篇 研究内容
    第一章 猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与流行病学调查
        摘要
        1 材料
            1.1 毒株及被检样本
            1.2 主要仪器设备
            1.3 主要试剂
        2 方法
            2.1 引物设计
            2.2 病毒RNA的提取
            2.3 反转录制备cDNA
            2.4 PCR条件的优化
            2.5 敏感性实验
            2.6 特异性实验
            2.7 病料的采集与RT-PCR方法的临床应用
        3 结果
            3.1 PCR反应条件的优化及反应体系的确定
            3.2 敏感性试验
            3.3 特异性试验
            3.4 病料RT-PCR检测结果
        4 讨论
        参考文献
        ABSTRACT
    第二章 PEDV部分S蛋白的原核表达
        摘要
        1 材料
            1.1 载体与菌种
            1.2 病毒、细胞与参考血清
            1.3 主要试剂
            1.4 主要仪器
        2 方法
            2.1 引物合成
            2.2 RT-PCR扩增目的片段
            2.3 PCR产物回收纯化
            2.4 PCR产物与原核表达载体的酶切处理
            2.5 酶切产物的回收和纯化
            2.6 目的基因与表达载体的连接
            2.7 重组质粒的鉴定
            2.8 重组蛋白的表达和鉴定
            2.9 重组蛋白稳定性分析
            2.10 重组蛋白表达条件的优化
            2.11 重组蛋白溶解性的判定
            2.12 重组蛋白的大量诱导和纯化
        3 结果
            3.1 S582基因的PCR扩增
            3.2 重组质粒的鉴定
            3.3 重组质粒的测序
            3.4 重组蛋白S582的SDS-PAGE鉴定
            3.5 Western blot鉴定重组蛋白反应原性
            3.6 重组蛋白稳定性和反应原性分析
            3.7 重组蛋白表达条件的优化
            3.8 重组蛋白溶解性的判定
            3.9 重组蛋白的亲和纯化
            3.10 复性重组蛋白的抗原性分析
            3.11 不同批次重组蛋白质量检测
        4 讨论
        参考文献
        ABSTRACT
    第三章 PEDV间接ELISA检测方法的建立与应用
        摘要
        1 材料
        2 方法
            2.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定
            2.2 抗原包被时间的选择
            2.3 封闭剂的选择
            2.4 封闭时间的确定
            2.5 一抗最佳反应时间的确定
            2.6 二抗最佳稀释倍数及反应时间的确定
            2.7 底物最佳反应时间的确定
            2.8 阴阳性临界值的确定
            2.9 特异性分析
            2.10 敏感性分析
            2.11 符合率分析
            2.12 重复性实验
            2.13 临床应用
        3 结果
            3.1 抗原最佳包被浓度及待检血清最佳稀释度的选择
            3.2 抗原最佳包被时间
            3.3 封闭液的选择
            3.4 封闭时间的确定
            3.5 一抗作用时间确定
            3.6 酶标二抗作用浓度和时间的确定
            3.7 底物最佳反应时间的确定
            3.8 阴阳性临界值的确定
            3.9 特异性分析
            3.10 敏感性分析
            3.11 符合率分析
            3.12 重复性实验
        4 讨论
        参考文献
        ABSTRACT
全文总结
致谢



本文编号：3817027