基于慢病毒的输卵管特异表达人溶菌酶转基因鸡制备

发布时间：2023-05-17 23:19

　　由于禽类独特的生殖系统,一个新生种鸡蛋已经是一个包含六万个左右细胞的鸡胚。鸡蛋的外壳坚硬,鸡蛋黄大而脆弱,不像哺乳动物的卵子是透明的从而便于显微注射操作。近年来随着慢病毒的广泛应用和鸡原始生殖细胞的成功培养,转基因鸡的制备主要使用慢病毒注射和鸡原始生殖细胞转移法这两种方法,获得的Go代转基因鸡外源基因的嵌合率高达52.2%。目前有细菌β-内酰胺酶,人类单克隆抗体和单链Fv-Fc融合蛋白等几种重组蛋白成功地在转基因鸡蛋清中表达,本研究成功地利用慢病毒制备了在蛋清中表达重组人溶菌酶的转基因鸡。 溶菌酶(LY)又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,广泛存在于牛奶,唾液,哺乳动物泪水以及禽类蛋白中。鸡溶菌酶(cLY)由129个氨基酸残基组成,分子质量为14.3kDa,人溶菌酶(hLV)由130个氨基酸残基组成,分子质量为14.7kDa,这两种蛋白的组成氨基酸有59%的同源性。尽管这两种溶菌酶的组成如此相近,人溶菌酶的抗菌活性却是鸡溶菌酶的三倍。人溶菌酶具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效,并且对人体完全无毒害、无副作用,是一种安全的抗感染物质和天然防腐剂,也是婴儿食品、饮料的良好添加剂。然而,天然...

【文章页数】：127 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文縮略词
第一章 文献综述
    1.1 转基因鸡研究进展
        引言
        1.1.1 受精卵操作法
        1.1.2 利用胚胎干细胞制备嵌合体
        1.1.3 原始生殖细胞转移法制备生殖系嵌合体
        1.1.4 利用病毒载体进行转基因
    1.2 慢病毒载体研究进展
        引言
        1.2.1 慢病毒
        1.2.2 慢病毒载体
        1.2.3 慢病毒载体的发展历程
        1.2.4 慢病毒假型化包膜的发展历程
        1.2.5 慢病毒载体的制备
        1.2.6 慢病毒载体的应用
    1.3 溶菌酶研究简介
        1.3.1 溶菌酶的分类
        1.3.2 重组人溶菌酶研究
    1.4 本研究的目的和技术路线
        1.4.1 研究目的
        1.4.2 技术路线
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 细胞系
        2.1.3 实验鸡蛋和种母鸡
        2.1.4 主要试剂
        2.1.5 试剂的配制
        2.1.6 实验仪器及耗材
        2.1.7 实验分析软件
    2.2 实验方法
        2.2.1 感受态细胞的制备
        2.2.2 感受态细胞的转化
        2.2.3 DNA片段的连接
        2.2.4 质粒DNA的制备
        2.2.5 PCR产物与酶切产物的胶回收
        2.2.6 PCR反应
        2.2.7 菌落PCR法
        2.2.8 总RNA的提取(Trizol法)
        2.2.9 RNA的反转录
        2.2.10 HotSHOT提取DNA法
        2.2.11 DNA的提取
        2.2.12 Southern Blot
        2.2.13 细胞蛋白提取
        2.2.14 蛋白定量
        2.2.15 Western Blot
        2.2.16 细胞培养
        2.2.17 病毒包装流程(Fugene HD转染方法)
        2.2.18 病毒滴度测定
        2.2.19 Genome Walking
        2.2.20 ELISA测定人溶菌酶含量
        2.2.21 免疫荧光
        2.2.22 替代壳制备
        2.2.23 鸡胚显微注射(胚盘下腔注射)
        2.2.24 第一次换壳操作
        2.2.25 第二次换壳操作
        2.2.26 鸡胚孵化
        2.2.27 鸡的采精与输精
第三章 G₀代嵌合体鸡的制备和检测
    引言
    3.1 载体构建
        3.1.1 载体构建的策略
        3.1.2 ERE和OV的克隆
        3.1.3 人工合成人溶菌酶cDNA序列
        3.1.4 慢病毒载体构建
    3.2 慢病毒包装
        3.2.1 慢病毒制备
        3.2.2 慢病毒滴度测定
    3.3 鸡胚注射及培养
        3.3.1 鸡胚注射
        3.3.2 鸡胚培养
        3.3.3 鸡胚注射及培养结果
    3.4 G₀代鸡外源基因检测
        3.4.1 G₀代鸡胚检测
        3.4.2 G₀代育成期鸡检测
第四章 转人溶菌酶鸡的制备和检测
    引言
    4.1 G₀代公鸡精液外源基因检测
    4.2 G₀代公鸡的传代
    4.3 G₁代转基因鸡鉴定
        4.3.1 PCR鉴定
        4.3.2 Southern Blot鉴定
        4.3.3 Genome Walking鉴定转基因插入位点
    4.4 G₁代转基因母鸡蛋白检测
    4.5 G₁代转基因鸡的传代
    4.6 G₂代转基因母鸡蛋白检测
    4.7 重组人溶菌酶在鸡输卵管特异性表达检测
        4.7.1 RT-PCR检测hLY的转录情况
        4.7.2 免疫荧光检测hLY在鸡输卵管的表达情况
    4.8 讨论
第五章 结论
参考文献
附录
致谢
作者简历



本文编号：3818201