猪链球菌2型双组份调控系统CiaRH调控基因SSU05 2 036和SSU05 2 039的功能研究
发布时间：2024-06-29 21:52
由猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2, S.suis2, SS2)引起的猪链球菌病是一种重要的人畜共患传染病,可导致猪的脑膜炎、心内膜炎、浆膜炎、关节炎、肺炎和败血症等。2005年中国四川暴发的猪链球菌病不仅给中国的养猪业带来了巨大的损失,还给公共卫生安全造成很大的威胁。因此,猪链球菌2型的致病机制成了国内外学者研究的热点。目前已经报道的SS2的毒力(相关)因子有：荚膜多糖CPS、溶菌酶释放蛋白MRP和细胞外因子EF、溶血素Sly、纤连蛋白结合蛋白FBPS、血清浑浊因子OSF、89K毒力岛和双组份调控系统等。 目前已经发现了15对猪链球菌2型的双组份调控系统如：CiaRH、SalK/SalR、 RevS和2148hk/rr等。CiaRH是肺炎链球菌中发现的第一对双组份调控系统,它不仅能对单一信号产生强烈反应,而且在各种条件下都能保持高水平的基因表达。CiaRH参与的反应过程有：感受态的形成、宿主定植、自溶、细菌素的产生和毒力等。同时CiaRH还参与生物被膜的形成,生物被膜在抗生素的耐受和细菌的免疫逃避方面发挥重要作用。 本课题组李锦铨博士通过构建Ci...
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1.前言
1.1 猪链球菌2型(SS2)的研究进展
1.1.1 猪链球菌2型的病原学及流行病学特征
1.1.2 猪链球菌2型毒力因子的研究进展
1.2 双组份调控系统的研究
1.2.1 双组份调控系统CiaRH的研究
1.2.2 CiaR调控的启动子中的csRNAs
1.2.3 CiaRH的调控机制
1.2.4 CiaRH对病原菌的毒力的作用
1.2.5 CiaRH对生物被膜的影响
1.3 细菌生物被膜的研究进展
1.3.1 病原菌生物被膜生成的相关影响因素
1.3.2 病原菌生物被膜与毒力的关系
1.3.3 病原菌生物被膜的致病机制
1.4 SSU052039和SSU052036基因功能的研究进展
1.4.1 SSU052039基因功能研究
1.4.2 SSU052036基因功能研究
2.研究目的与意义
3.材料与方法
3.1 材料
3.1.1 菌株、质粒和培养条件
3.1.2 动物和细胞
3.1.3 主要药品、试剂、试剂盒与仪器
3.1.4 主要培养基及抗生素配制
3.1.5 主要溶液配制
3.1.6 引物
3.2 实验方法
3.2.1 RNA的提取
3.2.2 反转录PCR
3.2.3 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)
3.2.4 蛋白质的诱导表达
3.2.5 蛋白质的鉴定(SDS-PAGE)
3.2.6 蛋白纯化
3.2.7 蛋白质浓度的测定
3.2.8 电泳迁移率实验(EMSA)
3.2.9 猪链球菌2型的电转化
3.2.10 突变株的筛选与鉴定
3.2.10.1 重组质粒的构建与鉴定
3.2.10.2 突变株的构建与鉴定
3.2.10.3 突变株△CiaRH的鉴定
3.2.11 突变株生物学特性的研究
3.2.11.1 生长曲线的测定
3.2.11.2 溶血活性的比较
3.2.12 96孔板结晶紫染色法
3.2.13 小鼠的半数致死量(LD50)实验(寇氏(Korbor)法)
3.2.14 小鼠组织载菌量的测定
3.2.15 吞噬实验(小鼠巨噬细胞RAW264.7)
4.实验结果与分析
4.1 突变株△CiaRH的鉴定及调控基因的筛选
4.1.1 突变株△CiaRH的验证
4.1.2 表达谱芯片筛选调控基因及SSU052036基因的重新命名
4.1.3 凝胶电泳迁移率(EMSA)体外结合试验结果分析
4.1.4 荧光定量验证(Real-Time PCR)
4.2 突变株△SSU052039和△SSU052036的重组质粒构建及筛选
4.2.1 △SSU052039和△SSU052036的重组质粒构建
4.2.2 突变株△SSU052039和△SSU052036的筛选与鉴定
4.3 突变株△SSU052036和△SSU052039的生物学特性研究
4.3.1 生长曲线的测定
4.3.2 溶血活性测定
4.4 生物被膜结果分析
4.5 突变株△SSU052036和△SSU052039对小鼠致病力的影响
4.5.1 小鼠LD50(半数致死量)的测定
4.5.2 组织载菌量的结果分析
4.6 吞噬实验结果分析
5.讨论
5.1 突变株的构建
5.2 CiaRH的调控基因SSU052036和SSU052039对生物被膜的影响可能的机制
5.3 吞噬试验结果讨论
5.4 CiaRH调控基因SSU052036和SSU052039的后续研究展望
6.结论
参考文献
致谢
本文编号：3997943
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1.前言
1.1 猪链球菌2型(SS2)的研究进展
1.1.1 猪链球菌2型的病原学及流行病学特征
1.1.2 猪链球菌2型毒力因子的研究进展
1.2 双组份调控系统的研究
1.2.1 双组份调控系统CiaRH的研究
1.2.2 CiaR调控的启动子中的csRNAs
1.2.3 CiaRH的调控机制
1.2.4 CiaRH对病原菌的毒力的作用
1.2.5 CiaRH对生物被膜的影响
1.3 细菌生物被膜的研究进展
1.3.1 病原菌生物被膜生成的相关影响因素
1.3.2 病原菌生物被膜与毒力的关系
1.3.3 病原菌生物被膜的致病机制
1.4 SSU052039和SSU052036基因功能的研究进展
1.4.1 SSU052039基因功能研究
1.4.2 SSU052036基因功能研究
2.研究目的与意义
3.材料与方法
3.1 材料
3.1.1 菌株、质粒和培养条件
3.1.2 动物和细胞
3.1.3 主要药品、试剂、试剂盒与仪器
3.1.4 主要培养基及抗生素配制
3.1.5 主要溶液配制
3.1.6 引物
3.2 实验方法
3.2.1 RNA的提取
3.2.2 反转录PCR
3.2.3 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)
3.2.4 蛋白质的诱导表达
3.2.5 蛋白质的鉴定(SDS-PAGE)
3.2.6 蛋白纯化
3.2.7 蛋白质浓度的测定
3.2.8 电泳迁移率实验(EMSA)
3.2.9 猪链球菌2型的电转化
3.2.10 突变株的筛选与鉴定
3.2.10.1 重组质粒的构建与鉴定
3.2.10.2 突变株的构建与鉴定
3.2.10.3 突变株△CiaRH的鉴定
3.2.11 突变株生物学特性的研究
3.2.11.1 生长曲线的测定
3.2.11.2 溶血活性的比较
3.2.12 96孔板结晶紫染色法
3.2.13 小鼠的半数致死量(LD50)实验(寇氏(Korbor)法)
3.2.14 小鼠组织载菌量的测定
3.2.15 吞噬实验(小鼠巨噬细胞RAW264.7)
4.实验结果与分析
4.1 突变株△CiaRH的鉴定及调控基因的筛选
4.1.1 突变株△CiaRH的验证
4.1.2 表达谱芯片筛选调控基因及SSU052036基因的重新命名
4.1.3 凝胶电泳迁移率(EMSA)体外结合试验结果分析
4.1.4 荧光定量验证(Real-Time PCR)
4.2 突变株△SSU052039和△SSU052036的重组质粒构建及筛选
4.2.1 △SSU052039和△SSU052036的重组质粒构建
4.2.2 突变株△SSU052039和△SSU052036的筛选与鉴定
4.3 突变株△SSU052036和△SSU052039的生物学特性研究
4.3.1 生长曲线的测定
4.3.2 溶血活性测定
4.4 生物被膜结果分析
4.5 突变株△SSU052036和△SSU052039对小鼠致病力的影响
4.5.1 小鼠LD50(半数致死量)的测定
4.5.2 组织载菌量的结果分析
4.6 吞噬实验结果分析
5.讨论
5.1 突变株的构建
5.2 CiaRH的调控基因SSU052036和SSU052039对生物被膜的影响可能的机制
5.3 吞噬试验结果讨论
5.4 CiaRH调控基因SSU052036和SSU052039的后续研究展望
6.结论
参考文献
致谢
本文编号：3997943
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