绵羊白介素1β及其受体拮抗因子荧光定量PCR检测方法的建立与应用

发布时间：2017-05-20 16:16

  本文关键词：绵羊白介素1β及其受体拮抗因子荧光定量PCR检测方法的建立与应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：白介素1β(IL-1β)和白介素1受体拮抗因子(IL-1Ra)是白介素1家族的两种重要成员。白介素1家族不仅是先天免疫系统的重要组成部分,而且对后天免疫系统也起到调节作用。IL-1β可以协同一些细胞因子来刺激T、B细胞分化,由于IL-1Ra与IL-1β三维结构相似,IL-1Ra能够与IL-1β竞争细胞膜表面的I型白介素1受体(IL-1RI),但是IL-1Ra与IL-1RI结合不能产生异物二聚体进而不能传导细胞信号,从而起到拮抗IL-1β的生物学活性。研究表明,IL-1β与IL-1Ra二者之间的平衡关系与一些疾病的发生发展相关,例如:关节炎、炎症性肠病、肉芽肿及中枢神经系统疾病等。同时,本课题组前期研究发现,绵羊白介素1β及其受体拮抗因子的差异表达与布鲁氏菌等细菌感染也有一定的关系。本实验建立绵羊白介素1β(Oa IL-1β)及其受体拮抗因子(Oa IL-1Ra)反转录-实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测方法,根据Oa IL-1β(Gen Bank登录号为KC425612)及Oa IL-1Ra(Gen Bank登录号为KC425613)的m RNA序列,设计特异性引物扩增目的基因。将两种目的基因分别克隆至p MD-18T载体上,得到阳性重组质粒,以两种阳性重组质粒为标准质粒分别建立标准曲线,并且进行灵敏性、重复性和特异性分析实验。通过熔解曲线分析证明荧光定量PCR产物为特异性单峰且重复性良好。Oa IL-1β的线性关系表达式为y=-3.463 x+39.957,相关系数R2为0.9999,扩增效率为94.4%,变异系数CV介于0.28-1.45%,线性范围为4.68-1.58×107拷贝数/μL,最低检测限为4.68拷贝/μL,回收率为91.4%。Oa IL-1Ra的线性关系表达式为y=-3.3888 x+41.452,相关系数R2为0.9995,扩增效率97.3%,变异系数CV介于0.08-1.23%,线性范围为5.31-2.27×107拷贝/μL,最低检测限为5.31拷贝/μL,回收率为88.3%。运用本实验所建立的反转录-实时荧光定量PCR方法,分析182份临床布鲁氏菌病相关绵羊外周血白细胞样本中Oa IL-1β及Oa IL-1Ra基因转录的丰度,初步确定Oa IL-1β与Oa IL-1Ra之间转录表达的平衡关系,本研究所建立的Oa IL-1β和Oa IL-1Ra反转录-荧光定量PCR检测方法,为探讨Oa IL-1β与Oa IL-1Ra平衡关系对维持机体稳态和疾病诊疗的影响,以及能否用于辅助诊断布鲁氏菌感染与免疫提供可应用的检测方法,并为进一步研究Oa IL-1β与Oa IL-1Ra临床应用提供含量监测工具。
【关键词】：绵羊 白细胞 白介素1β 白介素1受体拮抗因子 反转录-实时荧光定量PCR
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S826
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 引言12-14
• 第一篇 文献综述14-28
• 第一章 IL-1 与IL-1Ra的研究进展14-24
• 1.1 IL-1 家族激动剂成员概述14-15
• 1.2 IL-1R与IL-1Ra15-16
• 1.3 IL-1 家族的作用机制及信号调控16-17
• 1.4 IL-1 的生物学功能17-18
• 1.5 IL-1 与IL-1Ra的平衡对疾病的影响18-22
• 1.6 IL-1β与IL-1Ra的检测方法22-24
• 第二章 荧光定量PCR技术在动物疾病方面研究进展24-28
• 2.1 荧光定量PCR技术原理24
• 2.2 荧光定量PCR分类24-25
• 2.3 荧光定量PCR特点25-26
• 2.4 荧光定量PCR的应用26-28
• 第二篇 研究内容28-73
• 第一章 绵羊白介素 1β RT-qPCR检测方法的建立28-47
• 1.1 材料28-30
• 1.2 方法30-38
• 1.3 结果38-45
• 1.4 讨论45-46
• 1.5 小结46-47
• 第二章 绵羊白介素1受体拮抗因子RT-qPCR检测方法的建立47-58
• 2.1 材料47-48
• 2.2 方法48-49
• 2.3 结果49-56
• 2.4 讨论56-57
• 2.5 小结57-58
• 第三章 OaIL-1β及Oa IL-1Ra RT-q PCR检测方法临床样品分析58-73
• 3.1 材料58
• 3.2 方法58-61
• 3.3 结果61-71
• 3.4 讨论71-72
• 3.5 小结72-73
• 结论73-74
• 参考文献74-82
• 导师简介82-83
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果83-84
• 致谢84

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：382171