山羊IFN-γ杂交瘤细胞的制备与鉴定

发布时间：2017-05-20 15:02

  本文关键词：山羊IFN-γ杂交瘤细胞的制备与鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：IFN-γ是反映机体细胞免疫功能水平的一个重要细胞因子,测定该细胞因子水平常用ELISA检测试剂盒,IFN-γ单抗则是该试剂盒最为关键的试剂之一。目前尚未见有关于山羊IFN-γ单克隆抗体的报道,且IFN-γ具有较强的种属特异性,无法利用其他物种的IFN-γELISA检测试剂盒评估其水平。基于上述原因,本试验利用纯化的山羊IFN-γ原核表达重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采集小鼠血清,建立并优化山羊IFN-γ抗体的ELISA测定方法;分离免疫小鼠脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,制备并筛选分泌抗山羊IFN-γ单抗的杂交瘤细胞。研究取得如下结果:1.包被抗原浓度为10 ug/mL,4℃包被12 h,免疫血清孵育时间为60 min,羊抗小鼠酶标抗体的稀释度为1:5000的条件下,ELISA测定抗山羊IFN-γ抗体能够获得最佳结果。免疫小鼠3次后,小鼠血清效价达到105;2.SP2/0骨髓瘤细胞经8-AG处理2次,可有效提高融合率,使其达到60%;3.筛选获得一株杂交瘤细胞5D5B8,分泌的单抗能够识别山羊rIFN-γ而不识别空载体标签融合蛋白,且与山羊IFN-γ阳性血清和Con A刺激的淋巴细胞培养上清反应呈阳性;4.筛选出的杂交瘤细胞,经过连续传代和反复冻存复苏后,仍能够稳定分泌IFN-γ单抗,培养上清的OD450值均在1.0左右;5.杂交瘤细胞培养上清效价为29,小鼠腹水效价为107,纯化单克隆抗体效价为106。结果表明,本研究成功建立了山羊IFN-γ抗体的ELISA测定方法及山羊IFN-γ单抗杂交瘤细胞的制备方法,并且获得一株能够稳定分泌识别山羊IFN-γ单抗的杂交瘤细胞,能够用于山羊IFN-γ在蛋白质水平上的检测。
【关键词】：山羊 IFN-γ ELISA 杂交瘤细胞
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827
【目录】：

• 摘要6-7
• abstract7-11
• 第一章 IFN-γ 研究进展11-21
• 1.1 IFN-γ 的分子生物学研究进展11-15
• 1.1.1 IFN-γ 的结构11-12
• 1.1.2 IFN-γ 受体12-14
• 1.1.3 IFN-γ 的作用机制14-15
• 1.2 IFN-γ 的理化性质和免疫学活性15-16
• 1.2.1 IFN-γ 的理化性质15
• 1.2.2 IFN-γ 的免疫学活性15-16
• 1.3 IFN-γ 与疾病16-19
• 1.3.1 IFN-γ 的抗病毒作用16-17
• 1.3.2 IFN-γ 与自身免疫病的关系17-18
• 1.3.3 IFN-γ 与肿瘤18-19
• 1.4 IFN-γ 检测方法研究进展19-20
• 1.5 本研究的目的意义20-21
• 第二章 山羊IFN-γ 抗体的制备及其ELISA检测方法的建立21-32
• 2.1 材料21-24
• 2.1.1 菌株21
• 2.1.2 实验动物21
• 2.1.3 主要试剂21
• 2.1.4 主要仪器21-22
• 2.1.5 主要溶液的配制22-24
• 2.2 方法24-27
• 2.2.1 山羊IFN-γ 融合蛋白的诱导表达24-25
• 2.2.2 山羊rIFN-γ 的纯化25
• 2.2.3 小鼠免疫及其抗体的制备25-26
• 2.2.4 ELISA检测方法的建立26-27
• 2.3 结果27-30
• 2.3.1 山羊rIFN-γ 的诱导表达鉴定结果27
• 2.3.2 羊抗小鼠IgG酶标抗体的优选稀释度27-28
• 2.3.3 山羊rIFN-γ 的优化包被浓度28
• 2.3.4 山羊rIFN-γ 的优化包被时间28-29
• 2.3.5 免疫血清孵育时间的优化结果29
• 2.3.6 重复性试验结果29
• 2.3.7 抗山羊rIFN-γ 抗体效价测定结果29-30
• 2.4 讨论30-31
• 2.5 小结31-32
• 第三章 杂交瘤细胞的制备与鉴定32-42
• 3.1 材料32-33
• 3.1.1 实验动物32
• 3.1.2 细胞32
• 3.1.3 主要试剂32
• 3.1.4 主要仪器32
• 3.1.5 主要溶液的配方32-33
• 3.2 方法33-36
• 3.2.1 抗原制备和小鼠免疫33-34
• 3.2.2 细胞融合34
• 3.2.3 杂交瘤细胞阳性克隆筛选34
• 3.2.4 阳性杂交瘤细胞克隆化-有限稀释法34
• 3.2.5 稳定性试验34-35
• 3.2.6 空载体融合标签蛋白的诱导表达35
• 3.2.7 采集山羊外周血，分离血清及单个核细胞35
• 3.2.8 杂交瘤细胞特异性鉴定35
• 3.2.9 小鼠腹水的制备及纯化35-36
• 3.2.10单克隆抗体效价的测定36
• 3.3 结果36-40
• 3.3.1 小鼠血清效价的测定结果36
• 3.3.2 细胞融合及阳性杂交瘤细胞筛选结果36-37
• 3.3.3 阳性杂交瘤细胞克隆化结果37-38
• 3.3.4 稳定性试验结果38
• 3.3.5 杂交瘤细胞特异性鉴定结果38
• 3.3.6 单克隆抗体纯化结果38-39
• 3.3.7 单克隆抗体效价的测定结果39-40
• 3.4 讨论40-41
• 3.5 小结41-42
• 结论42-43
• 参考文献43-50
• 致谢50-51
• 作者简介51

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  本文关键词：山羊IFN-γ杂交瘤细胞的制备与鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

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