产酸性木聚糖酶链霉菌的鉴定、产酶条件优化及其基因克隆与表达

发布时间：2017-05-20 12:22

  本文关键词：产酸性木聚糖酶链霉菌的鉴定、产酶条件优化及其基因克隆与表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：半纤维素在秸秆中含量仅次于纤维素,是地球上第二大类可再生自然资源有机物。但大多数作为废弃物被浪费。我国拥有丰富的秸秆资源,但大多数作为废弃物被浪费,或者被焚烧对环境造成极大的威胁。如何有效利用秸秆中的半纤维素,将其转化为可利用的资源和能源是一个亟待解决的问题。植物半纤维素可被以木聚糖酶为主的半纤维素酶降解,木聚糖酶在造纸工业、食品行业、饲料添加剂等领域中显示的诸多应用价值不可小觑。本研究从土样和滩羊瘤胃内容物中分离产木聚糖酶的菌株,并对产酶水平高的菌株进行种属鉴定,同时分析其所产酶的酶学特性、产酶条件优化,并研究其所产木聚糖酶对三种粗饲料(麦秸、玉米秸秆、苜蓿草粉)的降解效果,通过分子生物技术克隆编码木聚糖酶的基因,并将其在大肠杆菌中进行原核表达,对其重组木聚糖酶的酶学性质进行评价,为该酶作为酶制剂应用于粗纤维饲料降解提供依据。试验结果如下:1.试验采用刚果红染色法和发酵液法从滩羊瘤胃内容物及土壤中筛选到6株能够分解木聚糖的细菌,其中分离于土壤中的菌株WL003,酶活高达20.68 U/mL。通过生理生化特性及系统发育树的构建进行种属鉴定,鉴定为灰略红链霉菌,属于革兰氏阳性菌。2.菌株WL003适宜在pH为6.0、培养温度32℃、180 rpm条件下生长,发酵7 d达到产酶高峰,以麦秸(10%)为碳源、牛肉膏为氮源进行液体发酵培养,并且在发酵培养液中添加0.1%的吐温-80能够使菌株表现更好的产酶能力,经过优化酶活提高了2.46倍。粗酶液对麦秸的降解效果最好,苜蓿草粉最差。3.菌株WL003分泌的木聚糖酶最适温度为65℃,最适pH值为4.5,经30℃~55℃处理10 min,残余酶活不低于80%;经pH 3.5~11.0范围内处理1.5 h后,残余酶活不低于88%;吐温-80可激活木聚糖酶活力,Cu2+、SDS及β-巯基乙醇则极大地抑制酶活。4.克隆了灰略红链霉菌WL003木聚糖酶基因xyn130,完整的阅读框全长1320 bp,编码氨基酸439个,理论的分子量和pI分别为47.25 kDa和5.86;基因xyn130编码的蛋白为亲水性稳定蛋白,有3个糖基化位点,20个磷酸化位点。该酶属于糖苷水解酶家族GH10,Glu-170、Glu-278和Asn-343为XYN130可能的催化残基,具有GH10家族典型的(β/α)8构型。5.构建重组表达载体pET-xyn130,经转化实现其在E.coli BL21(DE3)中的分泌表达,在0.2 mmol/L IPTG条件下诱导时间为6 h,获得最高诱导酶活。重组木聚糖酶最适温度为60℃,最适pH为5.5。在30℃~75℃范围内有较好的耐热性,对于75℃以上表现不耐受;在pH 3.5~11.0范围内耐受性很好,对于pH 3.0和pH 12.0表现极不耐受;Cu2+、SDS、β-巯基乙醇、EDTA、Mn2+和Zn2+不同程度地抑制重组酶酶活,其中Cu2+表现为极强抑制,SDS强抑制。结论:采用刚果红染色法从土样选育到一株产酸性木聚糖酶的灰略红链霉菌WL003,优化后酶活提高了2.46倍,发酵液对麦秸降解效果最理想,苜蓿草粉最差。成功克隆了木聚糖酶基因xyn130(NO.KU860088),该基因全长1320 bp,连续编码439个氨基酸,理论分子量为47.25 kDa,等电点pI为5.86。成功实现木聚糖酶基因xyn130在大肠杆菌中的表达,重组酶最适温度和pH分别为60℃和5.5,SDS较大程度地抑制酶活,而Cu2+则使酶彻底失活。
【关键词】：链霉菌 木聚糖酶 种属鉴定 产酶条件优化 基因克隆 原核表达
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S816.3
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 文献综述13-25
• 1.1 半纤维简介13-15
• 1.1.1 半纤维素概念13-14
• 1.1.2 木聚糖的结构和理化性质14-15
• 1.2 木聚糖酶研究进展15-21
• 1.2.1 木聚糖酶的分类15-16
• 1.2.2 木聚糖酶的来源及分子结构16-17
• 1.2.3 木聚糖酶的分子生物学和基因克隆17-21
• 1.3 木聚糖酶的研究现状21-23
• 1.3.1 木聚糖酶在畜牧业中的应用21-23
• 1.3.2 木聚糖酶在造纸工业上的应用23
• 1.3.3 木聚糖酶在食品工业中的应用23
• 1.4 本研究的目的和意义23-25
• 第二章 产木聚糖酶菌株的筛选及鉴定25-31
• 2.1 材料25
• 2.1.1 样品采集25
• 2.1.2 主要仪器25
• 2.1.3 主要试剂25
• 2.1.4 培养基和主要溶液的配制25
• 2.2 方法25-26
• 2.2.1 菌株初筛、纯化及复筛25-26
• 2.2.2 绘制木糖标准曲线26
• 2.2.3 测定粗酶液酶活26
• 2.2.4 菌株的形态学、培养特征和生理生化鉴定26
• 2.2.5 菌株的种属鉴定26
• 2.3 结果与分析26-30
• 2.3.1 木糖标准曲线的绘制26-27
• 2.3.2 木聚糖分解菌的筛选27-28
• 2.3.3 菌株形态学鉴定28
• 2.3.4 培养特征和生理生化特征28-29
• 2.3.5 菌株WL003的 16S rDNA序列分析29-30
• 2.4 讨论30
• 2.5 小结30-31
• 第三章 链霉菌木聚糖酶酶学特性及产酶条件优化分析31-41
• 3.1 材料31
• 3.1.1 菌株来源31
• 3.1.2 主要仪器31
• 3.1.3 主要试剂31
• 3.2 方法31-32
• 3.2.1 菌株WL003木聚糖酶酶学性质分析31-32
• 3.2.2 菌株WL003产酶条件优化32
• 3.2.3 菌株WL003产木聚糖酶对粗纤维的降解效果测定32
• 3.2.4 数据分析32
• 3.3 结果与分析32-38
• 3.3.1 菌株WL003所产木聚糖酶的酶学性质分析32-35
• 3.3.2 链霉菌WL003的产酶条件优化35-38
• 3.3.3 粗纤维降解效果的分析38
• 3.4 讨论38-40
• 3.4.1 野生菌分泌的木聚糖酶酶学特性分析38-39
• 3.4.2 发酵条件对链霉菌WL003的产酶影响39-40
• 3.5 小结40-41
• 第四章 木聚糖酶基因克隆与表达41-55
• 4.1 材料41
• 4.1.1 菌株和质粒41
• 4.1.2 主要试剂41
• 4.1.3 主要仪器41
• 4.1.4 引物41
• 4.2 方法41-43
• 4.2.1 木聚糖酶基因PCR扩增41-42
• 4.2.2 双酶切体系和连接体系42
• 4.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备方法42
• 4.2.4 木聚糖酶基因在大肠杆菌的诱导表达42-43
• 4.2.5 重组木聚糖酶酶学性质分析43
• 4.3 序列相关生物信息学分析43
• 4.3.1 xyn130基因序列分析43
• 4.3.2 XYN130的亲水性/疏水性分析43
• 4.3.3 XYN130磷酸化位点预测43
• 4.3.4 XYN130的二级结构和三级结构的预测43
• 4.3.5 XYN130的同源性比较和系统发育树分析43
• 4.4 结果与分析43-53
• 4.4.1 WL003木聚糖酶基因xyn130的克隆43-44
• 4.4.2 序列相关生物信息学分析44-48
• 4.4.3 木聚糖酶基因xyn130在大肠杆菌BL21（DE3）中的诱导表达48-50
• 4.4.4 重组木聚糖酶的酶学性质分析50-53
• 4.5 讨论53-54
• 4.5.1 木聚糖酶的基因克隆53
• 4.5.2 重组木聚糖酶在大肠杆菌中的原核表达53-54
• 4.5.3 重组木聚糖酶的酶学性质分析54
• 4.6 小结54-55
• 第五章 结论、创新点以及进一步研究内容55-56
• 5.1 结论55
• 5.2 创新点55
• 5.3 进一步研究内容55-56
• 参考文献56-63
• 附录63-71
• 致谢71-72
• 作者简介72

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本文编号：381623