猪δ冠状病毒E和S1蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

发布时间：2017-05-20 07:15

  本文关键词：猪δ冠状病毒E和S1蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronaviruses,PDCoV)属于冠状病毒科δ冠状病毒属,2012年在香港的猪群中检测到该病毒,并于2014年在美国爆发后在全世界范围传播。目前还没有可用于猪δ冠状病毒诊断和预防的商用试剂或疫苗,因此对猪δ冠状病毒疫苗和诊断方法的研究是非常重要的。猪δ冠状病毒E蛋白和S蛋白是该病毒的重要结构蛋白,在病毒成熟过程中S蛋白被蛋白酶切割成S1和S2,S2区域比较保守,抗原位点和变异区主要在S1区域;E蛋白是小包膜蛋白,对于猪δ冠状病毒在宿主的组装和侵染有重要作用。本研究将猪δ冠状病毒HKU15-44株E蛋白和S1蛋白作为抗原分别免疫新西兰兔,并对兔子产生的抗体效价进行测定。研究结果如下:1猪δ冠状病毒E蛋白载体构建与表达本研究合成的质粒pET21b-pSUMO-CoVE所表达的目的蛋白可溶性部分占比87%,可溶性良好但目的蛋白不便于纯化。利用PCR的方法将6×His标签与pET21b-pSUMO-CoVE质粒重组构建pET21b-6×His-pSUMO-CoVE重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)。诱导表达后经SDS-PAGE检测,结果表明成功构建了pET21b-6×His-pSUMO-CoVE重组质粒,并表达和纯化出His-CoVE目的蛋白,该蛋白分子量为56 KD,为研究猪δ冠状病毒E蛋白的免疫作用提供基础。2猪δ冠状病毒S1蛋白载体构建与表达本研究合成了pET21b-pSUMO-CoVS1质粒,经过SDS-PAGE电泳检测和灰度分析,pET21b-pSUMO-CoVS1所表达的目的蛋白可溶部分占比34%。为了促进目的蛋白的可溶性,利用载体重组的方法将CoVS1基因与八个可溶性标签相连构建了八个重组质粒:pET21b-6×His-Grifin-CoVS1、pET21b-6×His-GST-CoVS1、pET21b-6×His-MBP-CoVS1、pET21b-6×Hi s-SUMO-CoVS1、pET21b-6×His-Thioredoxin-CoVS1、pET21b-6×His-γ-crystallin-CoVS1、pE T21b-6×His-Ars C-CoVS1、pET21b-6×His-Ppi B-CoVS1。酶切鉴定结果表明成功构建了八个重组质粒,经过SDS-PAGE电泳检测和灰度分析,pET21b-6×His-MBP-CoVS1融合表达效果最好,目的蛋白可溶部分占比62%,与pET21b-pSUMO-CoVS1质粒相比融合蛋白可溶性提高1.8倍,并且成功纯化出MBP-CoVS1重组蛋白,MBP-CoVS1重组蛋白可用于下一步免疫试验。3猪δ冠状病毒E蛋白和S1蛋白免疫效果研究His-CoVE和MBP-CoVS1重组蛋白分别经过诱导表达和纯化后,与弗氏佐剂等体积混匀制备疫苗,每只1mg重组蛋白免疫新西兰兔。四免后一周采血分离血清,以Western-blot和ELISA方法检测免疫效果,以His-CoVE和MBP-CoVS1重组蛋白为抗原,分离的血清作为一抗,Western-blot结果表明His-CoVE和MBP-CoVS1在相应位置均有阳性条带;以猪δ冠状病毒CH-01包被抗原,分离的血清作为一抗,ELISA检测MBP-CoVS1组免疫后血清效价达到1:6400,His-CoVE组免疫后血清效价达到1:3200,均显著的高于对照组。本研究分离的血清可作为多克隆抗体用于PDCoV的诊断研究与中和试验,为PDCoV的诊断与预防提供理论基础和参考。
【关键词】：猪δ冠状病毒 S1蛋白 E蛋白 融合标签 多克隆抗体
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 缩略词4-5
• 致谢5-9
• 摘要9-11
• 1 文献综述11-19
• 1.1 冠状病毒11-12
• 1.2 猪δ冠状病毒12-14
• 1.2.1 猪δ冠状病毒发现与流行状况12-13
• 1.2.2 猪δ冠状病毒基因组特征13
• 1.2.3 猪δ冠状病毒感染临床症状13-14
• 1.2.4 猪δ冠状病毒的诊断方法14
• 1.3 冠状病毒结构蛋白14-16
• 1.3.1 Spike刺突糖蛋白14-15
• 1.3.2 M蛋白15
• 1.3.3 E蛋白15
• 1.3.4 N蛋白15-16
• 1.4 大肠杆菌表达系统及融合标签16-19
• 1.4.1 多聚组氨酸标签17
• 1.4.2 Grifin标签17
• 1.4.3 GST标签17
• 1.4.4 MBP标签17-18
• 1.4.5 SUMO标签18
• 1.4.6 Thioredoxin标签18
• 1.4.7 γ-crystallin标签18
• 1.4.8 ArsC标签18
• 1.4.9 PpiB标签18-19
• 2 引言19-20
• 3 材料与方法20-30
• 3.1 材料20-23
• 3.1.1 质粒和菌株20
• 3.1.2 主要仪器设备20
• 3.1.3 试剂20-23
• 3.1.3.1 主要试剂20-21
• 3.1.3.2 常规试剂及配制方法21-23
• 3.2 冠状病毒E蛋白的载体构建与表达23-26
• 3.2.1 合成目的基因23
• 3.2.2 PDCoV的E蛋白可溶性鉴定23-24
• 3.2.2.1 诱导表达23-24
• 3.2.2.2 纯化蛋白24
• 3.2.3 构建冠状病毒E蛋白载体24-25
• 3.2.3.1 引物设计与合成24
• 3.2.3.2 PCR扩增24-25
• 3.2.3.3 构建重组质粒His-CoVE25
• 3.2.4 冠状病毒E蛋白的表达与纯化25-26
• 3.2.4.1 冠状病毒E蛋白的表达25-26
• 3.2.4.2 冠状病毒E蛋白的纯化26
• 3.3 冠状病毒S1蛋白的载体构建与表达26-28
• 3.3.1 合成目的基因26
• 3.3.2 PDCoV的S1蛋白可溶性鉴定26-27
• 3.3.3 构建冠状病毒S1蛋白的载体27
• 3.3.4 冠状病毒S1蛋白的表达与纯化27-28
• 3.3.4.1 冠状病毒S1蛋白的可溶性标签筛选27-28
• 3.3.4.2 冠状病毒S1蛋白的纯化28
• 3.4 冠状病毒E和S1蛋白免疫作用的研究28-30
• 3.4.1 冠状病毒E和S1蛋白疫苗的制备28
• 3.4.2 动物分组及免疫28
• 3.4.3 冠状病毒E和S1蛋白免疫效果28-29
• 3.4.4 免疫血清抗体效价检测29-30
• 4 结果与分析30-39
• 4.1 冠状病毒E蛋白的载体构建与表达鉴定30-34
• 4.1.1 冠状病毒E可溶性鉴定30-31
• 4.1.2 冠状病毒E蛋白载体构建31-32
• 4.1.2.1 CoVE目的基因PCR结果31
• 4.1.2.2 载体双酶切结果31-32
• 4.1.2.2 His-CoVE菌液PCR鉴定结果32
• 4.1.3 E蛋白的表达与纯化结果32-34
• 4.1.3.1 His-CoVE的表达结果32-33
• 4.1.3.2 His-CoVE的纯化结果33-34
• 4.2 冠状病毒S1蛋白的载体构建与表达鉴定34-38
• 4.2.1 冠状病毒S1蛋白可溶性鉴定34
• 4.2.2 冠状病毒S1蛋白的载体构建34-36
• 4.2.2.1 pET21b-pSUMO-CoVS1和标签载体的双酶切结果34-35
• 4.2.2.2 CoVS1融合标签载体的双酶切鉴定结果35-36
• 4.2.3 冠状病毒S1蛋白的表达与纯化结果36-38
• 4.2.3.1 冠状病毒S1蛋白的可溶性标签筛选36-37
• 4.2.3.2 冠状病毒S1蛋白的纯化效果37-38
• 4.3 冠状病毒E和S1蛋白免疫作用的研究38-39
• 4.3.1 冠状病毒E和S1蛋白免疫效果38
• 4.3.2 免疫血清抗体效价检测38-39
• 5 结论与讨论39-41
• 5.1 讨论39-40
• 5.2 结论40-41
• 参考文献41-50
• 英文摘要50-51

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