CDK2AP1与鸡胚性腺发育相关基因调控关系初步研究
发布时间：2023-05-30 19:31
动物性腺的分化和发育一直是人们研究的热点,对生物学基础研究和繁殖疾病的治疗等方面有重要意义。研究发现哺乳动物性别开关基因SRY,而禽类的性别决定和性腺发育调控机制还不清楚。本实验室筛选出早期鸡胚性腺发育过程中雌、雄个体差异表达基因CDK2AP1,在小鼠中的研究发现它对性腺的发育起着重要作用。本研究利用超表达和RNAi干涉技术,在DF-1细胞中研究该基因与鸡胚性腺发育生长相关基因间的调控关系,初步确定它在鸡胚性腺发育中的功能。研究结果如下： 1. WISH检测CDK2AP1在3.5d (St22)和4.5d (St25)鸡胚以及5.5d (St28)和6.5d(St30)泌尿生殖系统中的表达,结果显示该基因在3.5d(St22)和4.5d(St25)胚胎多种组织中均有表达,头部和四肢尤为明显,且雌、雄鸡胚差异显著。它在5.5d(St28)雌、雄性腺中表达差异不明显,6.5d(St30)雌性性腺中表达量高于雄性；在5.5d(St28)雌、雄性腺中表达范围和强度大于6.5d(St30)。 2.构建了CDK2AP1超表达载体RC ASBP.B-CDK2AP1-GFP和三个CDK2AP1干涉载体...
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
目录
摘要
Abstract
缩略词表
1 前言
1.1 研究背景
1.2 CDK2AP1研究进展
1.2.1 CDK2AP1基因
1.2.2 CDK2AP1功能与作用机制
1.3 研究目的与意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 试验鸡胚
2.1.2 细胞系和质粒
2.1.3 主要试剂及试剂盒
2.1.4 主要溶液配制
2.1.5 主要仪器和设备
2.2 试验方法
2.2.1 CDK2AP1正反义mRNA探针合成
2.2.2 WISH
2.2.3 CDK2AP1超表达载体构建
2.2.4 CDK2AP1干涉载体构建
2.2.5 脂质体转染CDK2AP1超表达和干涉载体
2.2.6 qPCR检测mRNA水平超表达和干涉效果
2.2.7 Western blot检测蛋白水平超表达和干涉效果
2.2.8 流式细胞仪检测细胞周期
3 结果
3.1 pGEM-T-CDK2AP1载体的鉴定
3.2 斑点杂交检测正反义探针效率
3.3 CDK2AP1在鸡胚和性腺中的表达
3.3.1 CDK2AP1克隆载体的构建
3.3.1.1 CDK2AP1的扩增
3.3.1.2 酶切和测序鉴定
3.3.2 逆转录病毒超表达载体构建
3.3.2.1 pSlax-13-CDK2AP1-GFP重组载体构建
3.3.2.2 CDK2APl超表达载体构建
3.3.3 CDK2AP1RNAi干涉载体构建
3.3.3.1 U6-shRNA扩增
3.3.3.2 U6-shRNA克隆载体构建
3.3.3.3 pSlax-13-GFP-U6-shRNA重组载体的构建
3.3.3.4 RCASBP.B-GFP-U6-shRNA重组载体的构建
3.3.4 CDK2AP1超表达载体和RNAi载体转染
3.5 CDK2AP1超表达和RNAi效果检测
3.5.1 qPCR检测CDK2AP1表达情况
3.5.2 WB检测CDK2AP1表达情况
3.6 检测CDK2AP1与鸡胚性腺发育相关基因调控关系
3.6.1 qPCR检测ER、CDK2和TWIST2表达变化
3.6.2 qPCR和WB检测AR表达变化
3.6.3 qPCR和WB检测FOXO3a表达变化
3.7 CDK2AP1对细胞周期的影响
4 讨论
4.1 CDK2AP1在早期鸡胚中的表达
4.2 CDK2AP1在鸡胚泌尿生殖系统中的表达
4.3 CDK2AP1与AR的调控关系
4.4 CDK2AP1与FOXO3a和ERα的调控关系
4.5 CDK2AP1与CDK2和TWIST2的调控关系
4.6 CDK2AP1在鸡胚及性腺发育中的作用
5 小结
5.1 本研究所取得的结果
5.2 下一步需要研究的问题
参考文献
致谢
本文编号：3824896
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
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目录
摘要
Abstract
缩略词表
1 前言
1.1 研究背景
1.2 CDK2AP1研究进展
1.2.1 CDK2AP1基因
1.2.2 CDK2AP1功能与作用机制
1.3 研究目的与意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 试验鸡胚
2.1.2 细胞系和质粒
2.1.3 主要试剂及试剂盒
2.1.4 主要溶液配制
2.1.5 主要仪器和设备
2.2 试验方法
2.2.1 CDK2AP1正反义mRNA探针合成
2.2.2 WISH
2.2.3 CDK2AP1超表达载体构建
2.2.4 CDK2AP1干涉载体构建
2.2.5 脂质体转染CDK2AP1超表达和干涉载体
2.2.6 qPCR检测mRNA水平超表达和干涉效果
2.2.7 Western blot检测蛋白水平超表达和干涉效果
2.2.8 流式细胞仪检测细胞周期
3 结果
3.1 pGEM-T-CDK2AP1载体的鉴定
3.2 斑点杂交检测正反义探针效率
3.3 CDK2AP1在鸡胚和性腺中的表达
3.3.1 CDK2AP1克隆载体的构建
3.3.1.1 CDK2AP1的扩增
3.3.1.2 酶切和测序鉴定
3.3.2 逆转录病毒超表达载体构建
3.3.2.1 pSlax-13-CDK2AP1-GFP重组载体构建
3.3.2.2 CDK2APl超表达载体构建
3.3.3 CDK2AP1RNAi干涉载体构建
3.3.3.1 U6-shRNA扩增
3.3.3.2 U6-shRNA克隆载体构建
3.3.3.3 pSlax-13-GFP-U6-shRNA重组载体的构建
3.3.3.4 RCASBP.B-GFP-U6-shRNA重组载体的构建
3.3.4 CDK2AP1超表达载体和RNAi载体转染
3.5 CDK2AP1超表达和RNAi效果检测
3.5.1 qPCR检测CDK2AP1表达情况
3.5.2 WB检测CDK2AP1表达情况
3.6 检测CDK2AP1与鸡胚性腺发育相关基因调控关系
3.6.1 qPCR检测ER、CDK2和TWIST2表达变化
3.6.2 qPCR和WB检测AR表达变化
3.6.3 qPCR和WB检测FOXO3a表达变化
3.7 CDK2AP1对细胞周期的影响
4 讨论
4.1 CDK2AP1在早期鸡胚中的表达
4.2 CDK2AP1在鸡胚泌尿生殖系统中的表达
4.3 CDK2AP1与AR的调控关系
4.4 CDK2AP1与FOXO3a和ERα的调控关系
4.5 CDK2AP1与CDK2和TWIST2的调控关系
4.6 CDK2AP1在鸡胚及性腺发育中的作用
5 小结
5.1 本研究所取得的结果
5.2 下一步需要研究的问题
参考文献
致谢
本文编号：3824896
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3824896.html
