小反刍兽疫iELISA方法的建立及其H和F蛋白CTL表位的筛选

发布时间：2023-05-31 00:07

　　小反刍兽疫（PPR）是由小反刍兽疫病毒（PPRV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，主要感染山羊和绵羊，具有高发病率和致死率的特点。该病目前主要流行于撒哈拉以南的非洲、中东地区和印度次大陆。由于PPR的高致死率(70–80%)，OIE将其列为必须上报的动物传染病。 PPRV基因组为单股负链RNA，全长为15,948nt，其基因组共编码6种结构蛋白(N, P, M, F,H和L)和两种非结构蛋白（C和V）。H蛋白和F蛋白是囊膜上的两种糖蛋白，是病毒对于宿主的重要保护性抗原，能激发宿主产生中和抗体和保护性细胞免疫应答，是最适合应用于疫苗的两种蛋白。细胞免疫在机体对病毒的清除过程中发挥着不可或缺的作用，因此对H和F蛋白的细胞表位进行筛选对小反刍兽疫预防和控制意义重大。 本实验具体进行了如下研究： 1PPRV H蛋白膜外区的原核表达 利用原核表达系统对PPRV H蛋白的膜外区部分进行了表达，并对重组蛋白进行了纯化和western-blotting分析。结果显示，H蛋白膜外区部分得到了高效的表达，SDS-PAGE分析其大小为60ku左右，western-blotting分析证明其具有较好的...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 小反刍兽疫的研究进展
    1.1 引言
    1.2 病原学
        1.2.1 病毒的形态和理化特性
        1.2.2 病毒基因组和蛋白
        1.2.3 病毒的致病机理
    1.3 流行病学
        1.3.1 分布和流行地域
        1.3.2 易感动物
    1.4 疫苗学研究进展
        1.4.1 PPRV 野毒的驯化和弱毒疫苗的筛选
        1.4.2 小反刍兽疫疫苗
        1.4.3 展望
第二章 小反刍兽疫病毒 H 蛋白膜外区的表达与分析
    2.1 材料
        2.1.1 质粒与菌株
        2.1.2 试剂与溶液
    2.2 方法
        2.2.1 重组表达质粒的转化
        2.2.2 重组表达质粒的鉴定
        2.2.3 重组大肠杆菌的诱导表达
        2.2.4 重组蛋白的纯化
        2.2.5 纯化的重组 tH 蛋白的 SDS-PAGE 分析和定量
        2.2.6 纯化的重组 tH 蛋白的 western-blotting 分析
        2.2.7 小反刍兽疫病毒 H 蛋白的生物信息学分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 重组表达质粒的鉴定
        2.3.2 重组大肠杆菌的诱导表达
        2.3.3 纯化的重组 tH 蛋白的 SDS-PAGE 分析
        2.3.4 纯化的重组 tH 蛋白的定量
        2.3.5 纯化的重组 tH 蛋白的 western-blotting 分析
        2.3.6 小反刍兽疫病毒 H 蛋白的生物信息学分析
    2.4 讨论
第三章 小反刍兽疫间接 ELISA 检测方法的建立
    3.1 材料
        3.1.1 包被抗原、PPRV 阳性血清及阴性血清
        3.1.2 主要试剂与材料
        3.1.3 溶液
    3.2 方法
        3.2.1 间接 ELISA 检测方法具体操作步骤
        3.2.2 间接 ELISA 检测方法条件优化
        3.2.3 阴性样品临界值的确定
        3.2.4 敏感性试验
        3.2.5 重复性试验
        3.2.6 特异性试验
        3.2.7 临床样品检测中的应用
    3.3 结果与分析
        3.3.1 间接 ELISA 各最佳工作条件的确定
        3.3.2 判定标准的确定
        3.3.3 敏感性试验
        3.3.4 重复性试验
        3.3.5 特异性试验
        3.3.6 临床样品监测中的应用
    3.4 讨论
第四章 小反刍兽疫病毒 H 和 F 蛋白 CTL 细胞表位的筛选与鉴定
    4.1 材料
    4.2 方法
        4.2.1 小鼠免疫与免疫效果的检测
        4.2.2 PPRV H 和 F 蛋白 CTL 细胞表位的生物信息学预测和合成
        4.2.3 小鼠淋巴细胞的分离
        4.2.4 小鼠淋巴细胞的计数
        4.2.5 H 和 F 蛋白 CTL 表位的 ELISPOT 鉴定
        4.2.6 H 和 F 蛋白 CTL 表位的 ICS 鉴定
    4.3 结果与分析
        4.3.1 PPRV H 和 F 蛋白 CTL 细胞表位的生物信息学预测
        4.3.2 小鼠免疫效果检测
        4.3.3 小鼠淋巴细胞的分离制备及计数结果
        4.3.4 H 和 F 蛋白 CTL 表位的 ELISPOT 鉴定结果
        4.3.5 H 和 F 蛋白 CTL 表位的 ICS 鉴定结果
    4.4 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：3825300