基于单个B细胞抗体技术研制PRRSV特异性单克隆抗体
发布时间：2023-05-31 23:35
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种高度接触性传染病,临床症状主要是以母猪的繁殖障碍,仔猪呼吸道症状以及哺乳仔猪的高死亡率为特征。猪群会因感染PRRSV后所造成的持续性感染以及继发性感染,而导致猪群的生产性能下降,对养猪业造成了极大的经济损失,是目前影响养猪业健康发展的重要的疫病之一。PRRSV极易发生变异,流行毒株众多,而商品化弱毒疫苗的使用,也会导致流行毒与疫苗毒重组现象的发生,造成PRRS防控难度加大。诱导保护性免疫应答的PRRSV抗原结构仍然不是很清楚,有必要研制PRRSV不同结构蛋白的单克隆抗体,解析PRRSV的抗原结构,发现诱导中和抗体甚至广谱中和抗体应答的抗原表位,为PRRSV防控产品的研究提供理论依据。本研究中,利用多种商品化的PRRS弱毒疫苗和实验室自制流行毒株疫苗免疫猪,以诱导产生较高水平的中和抗体。同时纯化全病毒抗原,并用生物素...
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 猪繁殖与呼吸综合征简介
1.1.1 PRRSV的生物学特征
1.2 PRRSV的遗传变异
1.3 PRRSV的致病机制
1.4 PRRSV的免疫学特性
1.4.1 PRRS产生的体液免疫应答
1.4.2 PRRS产生的细胞免疫应答
1.5 PRRS的预防与控制
1.6 单个B细胞抗体技术简述
1.7 研究目的与意义
第二章 PRRSV抗原纯化与动物免疫试验
2.1 试验材料
2.1.1 试验动物
2.1.2 细胞和毒株
2.1.3 主要试剂
2.1.4 主要仪器
2.2 试验方法
2.2.1 PRRSV全病毒抗原的纯化
2.2.2 生物素标记PRRSV抗原及WB检测
2.2.3 试验动物免疫程序
2.2.4 静脉采血
2.2.5 全血RNA的提取
2.2.6 血液病毒血症的测定
2.2.7 病毒血清微量中和试验
2.3 试验结果
2.3.1 蔗糖密度梯度超速离心结果
2.3.2 PRRSV病毒粒子电镜观察结果
2.3.3 Western blot检测生物素标记PRRSV抗原结果
2.3.4 血液病毒血症的结果
2.3.5 病毒血清微量中和试验结果
2.4 讨论
第三章 FACS分选PRRSV抗原特异性单个B细胞以及猪源单克隆抗体的表达与鉴定
3.1 试验材料
3.1.1 主要试剂
3.1.2 主要仪器
3.2 试验方法
3.2.1 猪外周血单核细胞的分离
3.2.2 FACS分选单个B细胞
3.2.3 单细胞cDNA分子的制备及PCR扩增
3.2.4 载体构建与抗体质粒制备
3.2.5 小量表达抗体
3.2.6 间接免疫荧光试验(IFA)检测抗体的活性
3.2.7 表达抗体
3.2.8 抗体纯化
3.2.9 纯化后抗体的分析
3.2.10 间接免疫荧光试验(IFA)检测抗体的反应性
3.2.11 病毒中和试验检测抗体的中和活性
3.2.12 抗体识别抗原蛋白的鉴别
3.2.13 Western blot验证抗体识别抗原蛋白
3.2.14 分析9株抗体氨基酸序列
3.3 试验结果
3.3.1 PRRSV特异性B细胞FACS分选结果
3.3.2 单个B细胞PCR扩增结果
3.3.3 IFA检测抗体与PRRSV反应性的结果
3.3.4 抗体表达纯化的鉴定结果
3.3.5 抗体反应性检测结果
3.3.6 病毒中和试验结果
3.3.7 Western blot鉴别抗体识别抗原蛋白的结果
3.3.8 Western blot验证抗体识别抗原蛋白的结果
3.3.9 抗体可变区氨基酸比对分析结果
3.4 讨论
全文总结
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3826229
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
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摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 猪繁殖与呼吸综合征简介
1.1.1 PRRSV的生物学特征
1.2 PRRSV的遗传变异
1.3 PRRSV的致病机制
1.4 PRRSV的免疫学特性
1.4.1 PRRS产生的体液免疫应答
1.4.2 PRRS产生的细胞免疫应答
1.5 PRRS的预防与控制
1.6 单个B细胞抗体技术简述
1.7 研究目的与意义
第二章 PRRSV抗原纯化与动物免疫试验
2.1 试验材料
2.1.1 试验动物
2.1.2 细胞和毒株
2.1.3 主要试剂
2.1.4 主要仪器
2.2 试验方法
2.2.1 PRRSV全病毒抗原的纯化
2.2.2 生物素标记PRRSV抗原及WB检测
2.2.3 试验动物免疫程序
2.2.4 静脉采血
2.2.5 全血RNA的提取
2.2.6 血液病毒血症的测定
2.2.7 病毒血清微量中和试验
2.3 试验结果
2.3.1 蔗糖密度梯度超速离心结果
2.3.2 PRRSV病毒粒子电镜观察结果
2.3.3 Western blot检测生物素标记PRRSV抗原结果
2.3.4 血液病毒血症的结果
2.3.5 病毒血清微量中和试验结果
2.4 讨论
第三章 FACS分选PRRSV抗原特异性单个B细胞以及猪源单克隆抗体的表达与鉴定
3.1 试验材料
3.1.1 主要试剂
3.1.2 主要仪器
3.2 试验方法
3.2.1 猪外周血单核细胞的分离
3.2.2 FACS分选单个B细胞
3.2.3 单细胞cDNA分子的制备及PCR扩增
3.2.4 载体构建与抗体质粒制备
3.2.5 小量表达抗体
3.2.6 间接免疫荧光试验(IFA)检测抗体的活性
3.2.7 表达抗体
3.2.8 抗体纯化
3.2.9 纯化后抗体的分析
3.2.10 间接免疫荧光试验(IFA)检测抗体的反应性
3.2.11 病毒中和试验检测抗体的中和活性
3.2.12 抗体识别抗原蛋白的鉴别
3.2.13 Western blot验证抗体识别抗原蛋白
3.2.14 分析9株抗体氨基酸序列
3.3 试验结果
3.3.1 PRRSV特异性B细胞FACS分选结果
3.3.2 单个B细胞PCR扩增结果
3.3.3 IFA检测抗体与PRRSV反应性的结果
3.3.4 抗体表达纯化的鉴定结果
3.3.5 抗体反应性检测结果
3.3.6 病毒中和试验结果
3.3.7 Western blot鉴别抗体识别抗原蛋白的结果
3.3.8 Western blot验证抗体识别抗原蛋白的结果
3.3.9 抗体可变区氨基酸比对分析结果
3.4 讨论
全文总结
参考文献
致谢
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本文编号：3826229
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